人毛乳头细胞生物学研究及人真皮来源间充质干细胞的诱导分化

摘要

目的：（1）分离正常人毛乳头（dermal papilla, DP）并观察原代毛乳头细胞（dermal papilla cells, DPCs）在体外贴壁培养的生长特点。探讨DPCs的多潜能特性以及细胞因子的生物学影响。（2）探讨雌激素雌二醇（E2）对于体外培养的原代DPCs的生物钟基因Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3表达的影响。（3）探究一定比例的含有精氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸的多肽对人真皮来源间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）的诱导分化作用。
　　方法：（1）去除皮肤层和皮下多余脂肪组织，保留包裹脂肪组织的毛囊，胶原酶消化和振荡器振荡，镜下挑取散落的DP接种至培养板。观察细胞因子对原代DPCs生长的影响，并对其进行干细胞相关碱性磷酸酶（ALP、CDy1、SOX2和多能聚糖（versican）染色。（2）体外分离培养6月龄畸形引产胎儿头皮DPCs，2周后同步所有细胞生物钟活性，随机分为雌激素E2实验组和对照组。每间隔6小时提取一次总RNA，采用荧光定量PCR方法检测细胞中Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3等主要生物钟基因的表达量。余弦软件进行节律特征分析，实验组与对照组在同一时间点同一生物钟基因表达量采用独立样本t检验。（3）将包皮环切术后剩余皮肤组织剪成小块，分离酶消化2h后去除表皮，再用胶原酶消化1.5h分离真皮成纤维细胞，体外贴壁培养并多次传代，长时间胰酶应激和悬浮培养法分离真皮MSCs；CCK8法检测细胞在不同浓度多肽下生长活性；分别用含有这三种多肽和不含多肽的培养基体外诱导培养真皮MSCs，对比观察两组细胞形态的变化，并在培养的第3周和第6周，分别用神经细胞标记物巢蛋白（nestin）和神经丝L（NF-L）进行免疫荧光染色。
　　结果：（1）胶原酶消化和振荡之后的头皮组织变得松散，散落的DP脱落，呈梨形或者纺锤形。贴壁之后的DPs向外发散细胞，向四周呈发散性生长。培养基中添加细胞因子有助于DPCs增殖和多潜能特性的维持。ALP、CDy1、SOX2和versican荧光染色均呈阳性。（2）雌激素E2处理前后，DPCs的生物钟基因Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3均呈节律性表达（p<0.05）。经雌激素E2处理后，在同一时间点，实验组生物钟基因的表达量相对于对照组有不同程度增加，部分时间点有统计学意义（p<0.05）。（3）贴壁生长的真皮成纤维细胞呈长梭形，多次传代后得到纯化。分离的MSCs在悬浮培养基中呈球状生长；CCK8实验结果显示当精氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸的浓度分别为5 ng/mL、20 ng/mL和40 ng/mL时最有利于细胞的增殖，其增殖率与其他组相比有统计学意义（p<0.05）；在多肽6周的诱导作用下，MSCs的诱导分化为神经细胞，分化细胞在第3周和第6周分别显示nestin和NF-L阳性。
　　结论：（1）原代培养的DPCs在体外呈聚集性生长，表达干细胞相关抗原。（2）雌激素E2显著上调体外培养人DPCs的Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3基因的表达水平，其生物学意义值得深入研究。（3）含精氨酸，天冬氨酸和苯丙氨酸的三种多肽混合物的诱导培养液能促进真皮MSCs向神经细胞分化。

目录

声明

前言

实验一：毛乳头细胞原代培养及相关生物学研究

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

实验二：雌激素E2对体外培养人毛乳头细胞生物钟基因表达的影响

一、材料

二、方法：

三、结果

四、讨论

实验三：三种多肽体外诱导人真皮来源间充质干细胞分化为神经细胞

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

结论

参考文献

附录A 中英文术语缩略语对照

附录B 个人简历

附录C 综述:真皮干细胞在毛囊周期中的作用

致谢