HIV-1 P24病毒载量试剂盒的研发

摘要

获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病(AIDS)，是由免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。自从美国于1981年首次发现并定名以来，艾滋病以惊人的速度在全球传播。其流行规模之大，罹患人数之多，造成人类生命与社会经济损失之大均已超过历史上任何一种传染病。目前我国的艾滋病疫情仍呈上升趋势，发病和死亡依然严重，存在疫情进一步蔓延的危险。对HIV感染者进行HARRT治疗时检测患者体内的病毒载量是评价治疗效果的有效手段。RNA病毒载量检测法是目前较为敏感、应用较为广泛的方法。但现有的RNA病毒载量检测方法的检测仪器、检测试剂价格昂贵，且操作复杂，难以在一般实验室推广，也不适合广泛的临床应用。因此，价格相对便宜，操作简单的高灵敏度P24抗原检测方法的建立成为在发展中国家进行HIV病毒载量测定一种选择。本文对高质量的HIV-1 P24诊断用抗原、单抗、多抗，制备HIV-1P24病毒载量测定试剂盒进行了研究。主要内容包括： ⑴HIV-A1 P24抗原的表达和纯化：用套式多聚酶链式反应(nested-PCR)扩增HIV-A1 P24全长基因，并在基因上下游引入了酶切位点；然后P24基因插入到原核表达载体pTXB1中，构建原核表达质粒。该表达载体在大肠杆菌BL21中能够高效表达，使用破菌、几丁质亲和层析等步骤纯化P24抗原，纯化效果大于95％。 ⑵HIV-1 P24单克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的HIV-B亚型P24抗原免疫小鼠，用ELISA方法检测小鼠的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，取小鼠脾细胞与sp2/0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。用有限稀释法并结合药物筛选的方法对细胞进行筛选，最终筛选到4株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的细胞分别放大培养，并收获大量含有P24单抗的细胞上清。利用饱和硫酸铵沉淀法、蛋白G亲和层析的方法纯化P24抗原。 ⑶HIV-1 P24多克隆抗体的制备与纯化：用本科室保存的HIV-B亚型P24抗原免疫兔子，用ELISA方法检测兔子的体液免疫反应。最后一次免疫后一周，采用颈动脉采血法，获得大量含有P24多克隆抗体的兔血清，经多次正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对收获的P24兔多抗进行了纯化。最后用生物素对兔多抗进行了标记。 ⑷HIV-1 P24病毒载量测定试剂盒的初步建立和考核：使用本研究中制备的P24单克隆抗体、P24多克隆抗体，制备了HIV-1 P24病毒载量测定试剂盒，同时建立了试剂盒的标准步骤、P24抗原标准品和溶液体系(包括包被液、封闭液、稀释液、洗液)。最后对试剂盒的灵敏性和稳定性方面进行了初步考核。其最低检出浓度可达72pg/ml。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第1章 绪论

1.1 HIV概述

1.1.1 HIV流行病状况

1.1.2HIV1 P24概述

1.2 HIV1病毒载量检测方法概述

1.2.1HIV1 RNA病毒载量检测方法研究进展

1.2.2 HIV1 P24病毒载量检测方法研究进展

1.3本义主要研究内容

1.4本章小结

第2章HIV P24抗原蛋白表达与纯化

2.1材料和仪器

2.1.1主要的实验材料

2.1.2主要的仪器

2.2实验方法

2.2.1 HIVAl P24表达载体的构建和鉴定

2.2.2 HIV-Al P24蛋白在大肠杆菌BL21中的诱导表达和鉴定

2.2.3 P24蛋白的纯化和鉴定

2.3结果和讨论

2.3.1实验结果

2.3.2结果讨论

2.4本章小节

第3章HIV1-P24单克隆抗体的制备和纯化

3.1试剂和仪器

3.1.1实验材料

3.1.2实验仪器

3.2实验方法

3.2.1 BALB/c小鼠的免疫及抗体检测

3.2.2骨髓瘤细胞sp2/0的培养

3.2.3 小鼠脾细胞的制备

3.2.4杂交瘤细胞的融合

3.2.5杂交瘤细胞的筛选

3.2.6 HIV1 P24单克隆抗体的纯化

3.3结果与讨论

3.3.1实验结果

3.3.2结果讨论

3.4本章小结

第4章HIV1-P24多克隆抗体的制备与标记

4.1试剂和仪器

4.1.1实验材料

4.1.2实验仪器

4.2实验方法

4.2.1 HIV-1 P24兔多抗的制备

4.2.2多克隆抗体的生物素化标记

4.3结果和讨论

4.3.1实验结果

4.3.2结果讨论

4.4本章小结

第5章 HIV-1 P24抗原检测试剂盒的研制

5.2实验材料与仪器

5.2.1实验材料与试剂

5.2.2实验仪器

5.2实验方法

5.2.1实验方案的确定

5.2.2试剂盒缓冲体系的建立

5.3.3试剂盒的考核结果

5.3结果及分析

5.3.1 P24病毒载量试剂盒标准步骤

5.4本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间所发表的学术论文

致谢