基于无细胞系统的蛋白质芯片技术及其应用

摘要

蛋白质芯片技术具有高通量、高灵敏、检测迅速等优点。但却面临着蛋白质的高效表达与纯化、蛋白质在芯片表面的特异与有效固定及蛋白质活性的保持等问题。利用无细胞表达系统制备蛋白质芯片技术是一个新的发展方向。
　　 在本课题中，首先构建了12种pET24a-X-GSTs与16种pET28a-YS的有效重组克隆。之后，从中选取若干样品，采用基于兔网织红细胞裂解液的无细胞蛋白表达系统，通过三种策略制备了蛋白质芯片。第一种策略是非纯化靶蛋白芯片：在eppendorf管中分别表达重组蛋白，之后将表达体系不经纯化直接点于醛基片上，从而形成靶蛋白芯片。第二种策略是基于抗标签抗体捕获的纯化靶蛋白芯片：在试管中利用兔网织红细胞裂解液进行了体外蛋白质表达，再将反应体系直接孵育于固定有多克隆抗GST标签抗体的芯片基底上。C端融合GST标签的新生蛋白被固定于片基上的抗GST多克隆抗体捕获，在洗液清洗片基除去未结合杂质后形成相应的纯化蛋白芯片。之后基于此二芯片技术进行了一系列诸如：提高蛋白体外表达产量与芯片信号强度的优化实验。
　　 第三种策略是原位蛋白质芯片：生物素标记的线性DNA与生物素标记的多克隆抗GST抗体混合后被点于链亲和素包被的芯片基底上固定。之后将T7偶联的兔网织红细胞裂解液体外转录/翻译系统铺于片基表面表达C端融合GST标签的重组蛋白，重组蛋白被固定于片基表面的多克隆抗GST标签抗体原位捕获并固定。该策略不需对大量不同蛋白进行分离，并可使所有蛋白固定于特定位置，利用体外表达体系原位表达蛋白可获得高密度蛋白质芯片，并展示给我们一个通量化研究蛋白质功能的美丽前景。同时，由于通过引物预先引入了EcoRI酶切位点，因此在原位制备蛋白质芯片后，可通过加入EcoRI限制性内切酶反应体系切除固定的DNA模板，从而形成相对较纯的蛋白质芯片。
　　 在比较了三种策略后，实验选用了基于抗GST标签抗体捕获的纯化蛋白芯片技术结合传统PCR技术与线性化重组克隆技术进行了通量化蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）研究。这里实验采用了聚焦于人类肝转录因子的数据集作为样本，并结合基于无细胞系统的蛋白质芯片技术进行了通量化筛选研究，以检测人类肝脏中转录调控相关蛋白间的相互作用。
　　 实验筛选出79对阳性作用，其中包括14对已报道相互作用与65对未报道相互作用，暗示我们有大量的生物学信息有待于证实与发掘。在众多相互作用中，有6对已知相互作用未被检测到，其中有4对包含截短体蛋白，不排除相互作用功能域位于缺失部分。在上述实验的基础上，绘制了蛋白间的相助作用图谱。同时通过PRINCESS生物信息学预测来进行评估。最后，通过哺乳动物细胞表达及抗FLAG标签抗体芯片对其中的20个筛选结果进行了验证。结果16对相互作用结果一致，一致率为80％。包括的5对已报道相互作用中，4对为阳性，正确率80％。最终，实验实现了更高效的蛋白质相互作用筛选方式，获得的结果有助于加深我们对人类肝脏功能及其代谢调控机制的认识。

目录

文摘

英文文摘

主要英文缩写词

第1章 绪 论

1.1 研究背景

1.1.1 蛋白质芯片固定蛋白样品的表面化学原理

1.1.2 传统的蛋白质芯片技术

1.2 无细胞体外表达系统（cell-free expression system）

1.3 基于无细胞表达系统的非原位蛋白质芯片技术

1.3.1 直接点印法

1.3.2 光切割点印法（photocleavable print,PC-PRINT）

1.3.3 受体-配体结合法

1.4 利用无细胞表达系统原位制备蛋白质芯片的几种策略

1.4.1 核酸编程性蛋白阵列技术（Nucleic Acid Programmable Protein Array,NAPP A）

1.4.2 蛋白原位阵列技术（protein in situarray,PISA）

1.4.3 基于核糖体展示的原位蛋白质芯片技术（protein in situ immobilisation based on ribosome display,PISRD）

1.4.4“复印”法将DNA阵列转化为蛋白阵列（DNA array to protein array,DAPA）

1.5 总结

1.6 本课题思路

1.6.1 基于无细胞系统的非原位制备蛋白质芯片技术

1.6.2 基于无细胞系统的原位制备蛋白质芯片技术

1.7 本课题研究总技术路线

第2章 基于无细胞系统的非原位制备蛋白芯片技术

2.1 实验路线

2.1.1 分子克隆实验路线

2.1.2 无细胞体外蛋白表达

2.1.3 非原位制备蛋白质芯片技术

2.2 实验材料

2.2.1 质粒与菌株

2.2.2 工具酶与试剂

2.2.3 引物合成与测序

2.2.4 抗体

2.2.5 主要仪器

2.2.6 其他

2.3 实验方法

2.3.1 构建转录因子的重组克隆

2.3.2 基于无细胞表达系统的非原位靶蛋白质芯片技术

2.3.3 系列优化实验

2.4 结果与讨论

2.4.1 转录因子的重组克隆结果

2.4.2 非纯化靶蛋白芯片制备及两种片基的比较

2.4.3 兔网织红细胞裂解液中使用线/环DNA表达效果比较

2.4.4 系列优化实验

2.5 本章小结

第3章 原位制备蛋白质芯片

3.1 实验路线

3.2 实验材料

3.2.1 工具酶与试剂

3.2.2 引物

3.2.3 主要仪器

3.3 实验方法

3.3.1 原位制备蛋白质芯片的一般过程

3.3.2 对表达蛋白的检测

3.3.3 对固定DNA模板酶切前后的检测

3.4 结果与讨论

3.4.1 原位制备蛋白质芯片预实验

3.4.2 原位芯片DNA酶切时间比较

3.4.3 原位制备蛋白质芯片规模实验

3.5 本章小结

第4章 利用基于抗标签抗体捕获的纯化蛋白质芯片技术进行蛋白质功能研究

4.1 实验路线

4.1.1 通量化蛋白-蛋白相互作用筛选

4.1.2 蛋白-蛋白相互作用验证

4.2 实验材料

4.2.1 质粒与细胞

4.2.2 工具酶与试剂

4.2.3 引物

4.2.4 主要仪器

4.3 实验方法

4.3.1 线性化重组DNA技术的引入

4.3.2 通量化蛋白-蛋白相互作用检测

4.3.3 通量化蛋白-蛋白相互作用生物信息学预测

4.3.4 蛋白-蛋白相互作用验证实验

4.4 结果与讨论

4.4.1 检索涉及的蛋白-蛋白相互作用研究情况

4.4.2 通量化蛋白-蛋白相互作用检测

4.4.3 生物信息学预测蛋白-蛋白相互作用

4.4.4 蛋白-蛋白相互作用验证实验

4.5 本章小结

结 论

非原位制备蛋白质芯片技术

原位制备蛋白质芯片技术

利用基于抗标签抗体捕获的纯化蛋白质芯片技术进行蛋白质功能研究

参考文献

附 录

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致 谢