非苯醌结构格尔德霉素衍生物触发乳腺癌细胞发生不同的死亡形式

摘要

目的：
　　1.研究新型非苯醌类格尔德霉素衍生物DHQ3和17-DR对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及死亡的影响。
　　2.探寻 DHQ3和17-DR诱导的乳腺癌细胞死亡形式及其关键性蛋白表达的影响。
　　3.探寻DHQ3和17-DR对于热休克蛋白90（Hsp90）的客户蛋白表达的影响。
　　4.探寻DHQ3和17-DR在体内是否具有抗肿瘤作用。
　　方法：
　　1. MTT法检测DHQ3和17-DR对人乳腺癌细胞MDA-MB-231存活率的影响。
　　2.集落形成实验检测DHQ3和17-DR对细胞集落形成的影响。
　　3. PI单染法检测DHQ3和17-DR对MDA-MB-231细胞死亡率的影响。
　　4. Annexin V-FITC/PI双染法检测DHQ3和17-DR作用MDA-MB-231细胞24 h后对细胞死亡率的影响。
　　5. DAPI染色法观察DHQ3和17-DR作用在MDA-MB-231细胞后细胞核的改变。
　　6. ATP检测试剂盒检测不同浓度DHQ3和17-DR处理MDA-MB-231细胞后细胞内ATP水平。
　　7.电镜实验观察药物处理细胞后细胞亚显微结构的变化。
　　8.免疫印迹法检测坏死性凋亡相关蛋白、凋亡相关蛋白、Hsp90相关客户蛋白表达的变化。
　　9.免疫荧光法检测 DHQ3/17-DR处理 MDA-MB-231细胞后坏死性凋亡相关蛋白的定位变化。
　　10.使用siRNA下调MDA-MB-231细胞中RIP1、RIP3的表达后，检测药物对细胞的增殖抑制作用。
　　11.使用Malachite green法检测DHQ3和17-DR的Hsp90 ATPase活性。
　　12.通过肿瘤动物模型观察药物的体内抗肿瘤作用。
　　结果：
　　1. DHQ3和17-DR降低MDA-MB-231细胞的存活率
　　结果显示：MDA-MB-231的细胞存活率和DHQ3和17-DR作用浓度、作用时间均呈负相关关系，即DHQ3和17-DR对MDA-MB-231的增殖抑制逐渐增强。与此同时，细胞数量逐渐减少，且渐趋于变圆。选用低于细胞IC50的药物浓度作用于细胞时，集落形成明显减少。
　　2. DHQ3和17-DR诱导MDA-MB-231细胞发生不同的死亡形式
　　结果显示：随着药物作用浓度的提高，细胞死亡率增加；细胞核逐渐浓染，伴随着核碎裂的发生；细胞内ATP生成逐渐被抑制。电镜下观察到，DHQ3作用后的细胞呈现了细胞核凝聚、线粒体肿胀、细胞内容物外泄等坏死性凋亡的特征；17-DR作用后的细胞呈现细胞核皱缩、染色质边聚等凋亡的特征。
　　3.17-DR诱导MDA-MB-231细胞发生伴随caspase激活的凋亡
　　17-DR作用于细胞后，Mcl-1、Bcl-2表达明显降低，Bax表达显著升高；caspase-8、caspase-3、PARP均发生了明显的剪切。与广谱 caspase抑制剂z-VAD-fmk联用后，17-DR对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用被保护。
　　4. DHQ3诱导MDA-MB-231细胞发生坏死性凋亡
　　DHQ3作用细胞后，结果显示：DHQ3不能诱发 caspase-3和 caspase-8发生剪切，坏死性凋亡相关蛋白RIP1、RIP3、MLKL表达显著升高。坏死性凋亡特异性抑制剂Nec-1与其联用时，DHQ3对MDA-MB-231的增殖抑制作用明显被保护。
　　5. siRNA特异性地下调RIP1和RIP3实验进一步证明DHQ3诱导发生坏死性凋亡
　　使用有效序列下调RIP1和RIP3后，DHQ3对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用被部分保护，Nec-1对其的保护作用消失。
　　6. DHQ3和17-DR降低细胞内Hsp90客户蛋白的表达
　　结果证明：DHQ3和17-DR的 ATPase活性优于格尔德霉素；MDA-MB-231细胞内Hsp90客户蛋白的表达在DHQ3和17-DR作用后逐渐降低。蛋白酶体抑制剂MG132与其联用后，DHQ3和17-DR对于客户蛋白的影响减弱。
　　7. DHQ3和17-DR在体内实验中具有良好的抗肿瘤作用
　　肿瘤动物模型建立后，将其分为4组，DMSO组、DHQ3组、17-DR组、顺铂(DDP)组。实验结果显示：DHQ3和17-DR能够显著降低裸鼠体内肿瘤细胞的增长，且对肝肾的损伤较小。
　　8．DHQ3和17-DR诱导细胞发生不同死亡形式在其他肿瘤细胞中并未出现
　　将DHQ3与17-DR分别与Nec-1联合作用在多种肿瘤细胞上，同样的情况在乳腺癌细胞上出现，而在其他肿瘤细胞上并未发现，具体机制将有待进一步研究。
　　结论：
　　1. DHQ3和17-DR能够抑制人乳腺癌细胞的增殖。
　　2. DHQ3和17-DR诱导MDA-MB-231细胞发生不同的死亡形式。
　　3. DHQ3和17-DR可以下调Hsp90客户蛋白的表达。
　　4. DHQ3和17-DR具有良好的体内抗肿瘤作用。

目录

声明

前言

材料与方法

1 材料与仪器

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1、DHQ3和17-DR两种新型衍生物对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用

2、DHQ3和17-DR在同样条件下诱导细胞发生不同的死亡形式

3、17-DR作用后MDA-MB-231细胞发生伴随caspase激活的凋亡

4、DHQ3作用后MDA-MB-231细胞表现为坏死性凋亡

5、干扰RIP1/RIP3蛋白的表达进一步证明DHQ3诱导MDA-MB-231细胞发生坏死性凋亡

6、DHQ3和17-DR诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞中Hsp90的客户蛋白表达的降低

7、DHQ3和17-DR在体内的抗肿瘤作用

8、DHQ3和17-DR诱导细胞发生不同死亡形式在其他肿瘤细胞中并未出现

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A英中文术语缩略语表

附录B常用试剂配制方法

附录C个人简历及论文发表

附录D综述:细胞死亡形式研究进展