肺炎链球菌溶血素诱导巨噬细胞铁死亡发生的初步研究

摘要

目的：探究肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae，S.pn）感染是否会引起巨噬细胞发生铁死亡；其毒力蛋白溶血素（Pneumolysin，Ply）是否是参与该过程的重要因子；研究通过抑制铁死亡的发生是否可以减轻S.pn和Ply引起的炎症损伤。　　背景：铁死亡是一种近年新发现的铁依赖性脂质过氧化和活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）诱导的调节性细胞死亡。细胞铁死亡的发生可能会导致损伤相关模式分子（damageassociatedmolecularpatterns,DAMPs）释放，从而进一步加重炎症反应，在许多病原体诱导的感染免疫应答中发挥重要作用。S.pn感染过程中会导致宿主细胞损伤，这对于宿主抗感染非常不利。细胞铁死亡在S.pn与宿主免疫细胞相互作用中的角色尚未阐明。在前期实验中我们发现S.pn感染可诱导巨噬细胞胞内ROS的异常累积，且下调铁死亡负调控分子谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathioneperoxidase,GPx4）和溶质载体家族7成员11（solutecarrierfamily7membrane11,SLC7A11）的水平，而S.pn溶血素ply表达缺失时，GPx4和SLC7A11的下调被阻断。故我们推测铁死亡有可能参与了S.pn感染过程中所致的细胞死亡，影响炎症反应，而S.pn溶血素Ply是介导这一过程发生的重要毒力因子。　　主要研究方法　　1、体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，设NC组和不同MOI值的野生型D39感染组，通过亚铁嗪比色法检测胞质内不稳定铁离子、用硫代巴比妥酸（thibabituricacid,TBA）法检测脂质过氧化物丙二醛（malondialdehyde，MDA）在巨噬细胞内的累积水平，采用real-timePCR方法检测铁蛋白重链多肽1（ferritinheavychain1,FTH1）以及铁死亡负调控分子GPx4和SLC7A11的表达变化；　　2、为进一步证实溶血素Ply在肺炎链球菌介导巨噬细胞铁死亡过程中所起的关键作用，体外培养RAW264.7细胞，设NC组、野生型D39感染组、D39Δply感染组和D39Δply+rPly组，分别通过使用亚铁嗪比色法和TBA法检测胞质内游离铁离子、MDA在巨噬细胞中的累积水平，采用real-timePCR和Westernblot检测FTH1和铁死亡负调控分子GPx4、SLC7A11的表达变化;　　3、体外培养RAW264.7细胞，设NC组、rPly处理组和突变蛋白rPlyΔA146处理组，检测铁死亡相关指标的改变以验证Ply引起的铁死亡是否是依赖于其溶血活性。　　4、为了进一步明确铁死亡在肺炎链球菌感染和Ply诱导的细胞损伤和炎症反应中的作用，给予铁死亡特异性抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）来抑制巨噬细胞铁死亡的发生。通过CCK-8检测细胞存活率，以MitoTracker检测线粒体膜电位的情况，且在电镜下观察线粒体超微结构的变化来验证Fer-1是否可阻断野生型D39及rPly引起的巨噬细胞铁死亡线粒体的损伤；其次通过real-timePCR的方法检测在给予或不给予Fer-1的情况下，FTH1、SLC7A11和GPx4的转录水平；分别采用亚铁嗪比色法和TBA法检测铁离子和MDA水平；最后通过real-timePCR检测促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平，且通过吞噬杀伤实验检测巨噬细胞的功能情况。　　主要研究结果　　1、肺炎链球菌感染可导致巨噬细胞内储铁蛋白FTH1的降解，胞质内不稳定铁离子异常累积，脂质过氧化物MDA水平升高，铁死亡负调控分子GPx4和SLC7A11水平降低。　　2、Ply参与肺炎链球菌诱导的巨噬细胞铁死亡。当ply表达缺失，D39Δply感染不会引起RAW264.7巨噬细胞胞质内游离铁离子、MDA水平异常升高，以及GPx4和SLC7A11水平降低，而在D39Δply感染组RAW264.7细胞外源给予纯化rPly蛋白处理后，可显著下调铁死亡负调控分子GPx4和SLC7A11。　　3、Ply诱导的巨噬细胞铁死亡与其溶血活性有关，纯化rPly蛋白处理可介导巨噬细胞胞内不稳定铁离子异常累积，脂质过氧化物MDA水平升高，GPx4和SLC7A11水平降低，而无溶血活性的突变蛋白rPlyΔA146处理则不能诱导巨噬细胞发生铁死亡相关指标改变。　　4、铁死亡抑制剂Fer-1可在一定程度上抑制野生型D39及rPly蛋白诱导的巨噬细胞铁死亡发生，缓解细胞损伤，减轻细胞铁死亡引起的炎症反应。　　总结与讨论　　本研究证实了肺炎链球菌感染可导致巨噬细胞发生铁死亡，且毒力因子Ply是以依赖其溶血活性的方式参与该过程。铁死亡特异性抑制剂Fer-1可以通过抑制铁死亡的发生，从而减轻肺炎链球菌及溶血素Ply诱导的细胞损伤和炎症反应，促进巨噬细胞对肺炎链球菌的杀伤。我们初步阐释了一种新的肺炎链球菌诱导细胞死亡的机制，发现溶血素Ply在铁死亡中起到的关键作用。这些研究数据为认识肺炎链球菌诱导巨噬细胞死亡的机制提供了新的实验依据，并提示铁死亡可能是临床治疗肺炎链球菌感染，乃至其他感染性疾病的新思路。

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