β-石竹烯通过NRF2/HO-1调控铁死亡改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤研究

摘要

背景：缺血性脑卒中（ischemiastroke,IS）又称脑梗死（cerebralinfarction），是因各种原因所致脑部血液供应障碍，导致脑组织缺血、缺氧，使脑组织发生局灶性坏死和脑萎缩，继而出现相应神经功能缺损的临床表现。因其高发病率、高致死率和高致残率等特点，不仅严重危害人类身心健康，也造成了巨大的精神和物质损失。β-石竹烯（β-caryophyllene，BCP）是一种广泛存在于植物精油中的天然双环倍半萜类化合物，常见在于丁香油、大麻、迷迭香和啤酒花等,因其在多种疾病中有解毒、抗炎和抗氧化等多种药理作用而广受关注。铁死亡作为近年发现的新型细胞死亡方式，已被研究证明参与多种疾病的发生发展，例如肿瘤、肾衰竭和脑卒中等。目的：本研究旨在探讨铁死亡是否参与了急性缺血性脑卒中的发病机制，并观察BCP能否通过激活NRF2/HO-1信号通路调控铁死亡，从而减轻脑缺血再灌注损伤。　　方法:　　首先，我们通过评估大脑中动脉闭塞模型（MCAO/R）不同灌注时间后铁死亡标记物和脂质过氧化水平，并应用透射电镜观察造模后线粒体形态变化证实了铁死亡的发生。此外，采用改良神经功能缺损评分和TTC染色评价铁死亡抑制剂DFO对大鼠神经功能的保护作用，苏木精-伊红染色和尼式染色观察病理学形态改变，进一步阐明了铁死亡在大鼠急性缺血脑卒中的重要作用。然后，随机将大鼠分为假手术组、假手术+306mg/kgBCP、MCAO/R模型组、MCAO/R+204mg/kgBCP、MCAO/R+306mg/kgBCP、MCAO/R+408mg/kgBCP、依达拉奉阳性对照组，通过改良神经功能缺损评分、TTC染色和苏木精-伊红染色检测BCP对脑损伤的影响。并通过蛋白免疫印记、免疫荧光和免疫组化检测NRF2/HO-1信号通路和铁死亡关键蛋白的表达变化。　　在体外实验中，我们成功建立大鼠原代星形胶质细胞OGD/R模型，并观察了不同复氧时间铁死亡相关蛋白的表达水平，并应用FeRhoNox-1亚铁离子探针通过共聚焦显微镜观察细胞铁离子蓄积水平、DCFH-DA荧光探针采用流式细胞术检测ROS水平，探究铁死亡在星形胶质细胞OGD/R损伤中的作用。CCK-8检测细胞活力证实了铁死亡抑制剂预处理原代星形胶质细胞减轻了OGD/R诱导的细胞损伤。为了证明BCP在体外的神经保护作用，用不同浓度的BCP（10、20和40μM）预处理原代星形胶质细胞24小时，然后进行氧糖剥夺/再复氧（ODG/R）模型。随后测定细胞活力、ROS水平和亚铁离子水平。我们还进行了蛋白质印迹分析，检测铁死亡相关的蛋白如GPX4、COX2、ACSL4、NRF2和HO-1的表达水平。最后，我们应用NRF2抑制剂ML385检测其对大鼠神经功能损伤的作用，应用CCK-8法探究ML385对星形胶质细胞活力的影响，进一步阐明BCP保护缺血性脑卒中的分子机制。　　结果：　　成功建立大鼠大脑中动脉闭塞模型，通过神经功能评分、TTC染色、组织病理学和透射电镜分析证明了铁死亡存在于大鼠MCAO/R模型中，验证了铁死亡抑制剂DFO对急性脑卒中大鼠的保护作用。成功建立星形胶质细胞氧糖剥夺再复氧模型，FeRhoNox-1亚铁离子探针和DCFH-DA活性氧探针验证了OGD/R造模后星形胶质细胞亚铁离子蓄积和ROS水平升高。WB结果也表明MCAO/R损伤和OGD/R损伤对铁死亡相关蛋白具有诱导作用。体内研究表明，BCP改善了MCAO/R后的神经功能评分、减少了脑梗死体积和组织病理学损失。我们还发现，BCP可显著增加NRF2的核转位，从而上调了NRF2下游蛋白HO-1和GPX4的表达，从而抑制铁死亡。免疫荧光结果显示BCP下调了ACSL4的表达，上调了NRF2的表达并促进了NRF2入核。免疫组化结果显示BCP上调了GPX4的表达。　　体外研究显示了相同的结果，BCP通过激活NRF2/HO-1通路显著减轻了因OGD/R导致的细胞损伤，提高了细胞活力，降低了OGD/R诱导的ROS产生和铁积累。　　此外，NRF2抑制剂ML385逆转了BCP在体内和体外的神经保护作用，证明了BCP的神经保护作用和NRF2/HO-1通路有关。　　结论：　　1.明确了铁死亡在大鼠急性脑卒中损伤中起关键作用。　　2.验证了β-石竹烯在大鼠MCAO/R损伤和星形胶质细胞OGD/R损伤中的神经保护作用。　　3.首次发现了BCP一定程度上通过调控铁死亡从而发挥神经保护作用。　　4.发现了BCP可通过NRF2/HO-1通路调控铁死亡从而减轻大鼠急性脑卒中损伤。

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