黑鱼鱼肉ACE抑制肽的制备及快速筛选

摘要

高血压是严重影响人类健康的一类疾病，目前治疗高血压的药物血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂大多为化学合成的，这些药物作用效果明显，但它带来的副作用也不容小觑。食源性的生物活性肽具有显著的降压活性且无副作用，是当前研究的热点。本文以黑鱼鱼肉为原料，制备优化了ACEIPs的酶解条件，研究了ACEIPs的消化稳定性；建立了生物亲和超滤结合Nano–LC–ESI–Q–Orbitrap–MS/MS和分子对接快速筛选鉴定ACEIPs的方法，分析了ACEIPs和ACE两者之间的作用位点及相互作用力，探讨了筛选得到的两条新型的高活性ACEIPs的抑制类型。主要研究结果如下：　　（1）以ACE抑制活性和水解度为评价指标，从木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶中筛选出对酶解黑鱼鱼肉制备ACEIPs的最优酶，并考察酶解温度、酶解时间、pH、料液比和酶添加量等因素对最优酶制备ACEIPs的影响，测定了酶解物的分子量分布情况，最后探索了酶解物在模拟体内消化系统的稳定性，为其应用于食品开发方面提供理论依据。结果表明：碱性蛋白酶酶解物的ACE抑制活性最高为81.29%，水解度为23.23%，碱性蛋白酶为制备ACEIPs的最优酶。通过单因素实验和响应面优化实验对碱性蛋白酶的酶解条件进行优化，得到最佳酶解条件为酶解温度55℃、pH为9、酶添加量为5%、料液比1：20、时间3h，在此条件下得到的酶解物ACE抑制率为54.35%。测定酶解物的分子量分布，其主要由6个组分组成，近60%的肽分子量小于900Da，其中组分Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的相对含量分别为26.3%、49.9%和10.7%，占总含量的85%以上。酶解物在模拟消化前后ACE抑制活性未出现显著变化（P＞0.05），但其分子量分布情况发生了变化，分子量小的组分含量增加。　　（2）建立了生物亲和超滤结合Nano–LC–ESI–Q–Orbitrap–MS/MS和分子对接快速筛选鉴定ACEIPs的方法，探讨了LPGPGP和EYFR对ACE的抑制类型及其机制。确定最佳的初筛样品浓度为5mg/mL，与活性ACE结合后洗脱得到的组分（BPAA）的ACE抑制活性最高，表明生物亲和超滤可有效进行ACEIPs的初筛。通过质谱鉴定，组分BPAA中所特有的肽段共有30条（ALC?99%），使用分子对接模拟软件AutoDockTools进行二次筛选，结合能分布范围为-11.51kcal/mol至-3.81kcal/mol。合成结合能最低的14条肽，其中浓度为1mg/mL时ACE抑制率超过50%有7条，EYFR和LPGPGP显示出最强的ACE抑制活性，其IC50分别为179.2和186.3μM。分析肽和ACE的氨基酸残基结合情况发现，LPGPGP和EYFR主要是和ACE的S1活性口袋和S2活性口袋的氨基酸残基结合，但主要的作用力有所不同。根据Linweaver-Burk曲线判断LPGPGP和EYFR的抑制类型均为竞争性抑制。

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