广西民族药当归藤指纹图谱的建立及其活血补血作用研究

摘要

目的：1.建立广西民族药当归藤药材指纹图谱，为当归藤药材质量评价提供参考依据；2.当归藤活血作用研究，通过灌胃给药观察当归藤不同极性提取物对血瘀大鼠的干预作用；3.当归藤补血作用研究，通过灌胃给药观察当归藤不同极性提取物对血虚小鼠的干预作用。　　方法：1.指纹图谱研究：采用高效液相色谱法，采用Phenomenex Luna C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；以乙腈-0.1%磷酸作梯度洗脱，流速：0.8mL/min；检测波长：225nm；柱温：30℃，进样量：10μL。　　2.活血作用研究：将SPF级SD雄性大鼠按照体重随机分组：正常对照组、模型对照组、阳性对照组、当归藤石油醚组、当归藤乙酸乙酯组、当归藤正丁醇组、当归藤水部位组。于实验第1天开始灌胃给予受试药物，剂量如下：阳性对照组(丹参片，剂量0.324g/kg)、当归藤石油醚部位组（4.2g/kg）、当归藤乙酸乙酯部位组（10.64g/kg）、当归藤正丁醇部位组（22.078g/kg）、当归藤水部位组（5.0g/kg），空白对照组和模型对照组从给药第一天开始每天灌胃给予等量蒸馏水，所有组别大鼠每天灌胃给药2次，连续灌胃给药7天。给药第1天，除正常组外，其余各组大鼠置于特制鼠笼内，然后置于（-18±2℃）冰柜连续冷冻，每天两次，每次2h，连续7d，造成寒凝血瘀证大鼠模型。整个实验过程，严格控制室温在20±2℃，动物正常饮食。末次冷冻12h后，10%水合氯醛（0.40mL/100g）麻醉大鼠，腹主动脉取血5mL，室温静置1h后，4℃条件下3500-4000r/min离心10min，分装血清，-80℃冰箱保存备用，检测相应的指标。　　3.补血作用研究：选用SPF级KM雌性小鼠，按照体重随机分组：正常对照组、模型对照组、阳性对照组、当归藤石油醚部位、当归藤乙酸乙酯组、当归藤正丁醇组、当归藤水部位组。于实验第1天开始灌胃给予受试药物，剂量如下：当归藤石油醚部位（5.99g/kg），当归藤乙酸乙酯部位(15.21g/kg)，当归藤正丁醇部位(31.54g/kg)，当归藤水部位(7.15g/kg)，阳性对照组（当归补血口服液，剂量为2.6mL/kg），空白对照组和模型对照组从给药第一天开始每天灌胃给予相同容量的蒸馏水。所有组别小鼠每天灌胃给药1次，连续灌胃给药14天。在预防给药第12天和第13天，除空白对照组外，每只小鼠腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，连续2d，制备小鼠血虚模型，造模期间仍继续给药复制血虚动物模型，空白对照组动物皮下注射等容量生理盐水。末次给药后30min，拔眼球取血，室温静置1h后，4℃条件下3500-4000r/min离心10min，分装血清，-80℃冰箱保存备用，检测相应的指标。　　结果：1.建立了不同产地广西民族药当归藤HPLC指纹图谱，并标定了12个共有峰，并鉴定其中的两个特征峰的成分（儿茶素和没食子酸）；　　2.对其进行SPSS聚类分析，将不同产地的当归藤分为两类，其中的3个产地聚为一类，其他的产地聚为一类；　　3.12批当归藤药材HPLC指纹图谱与对照图谱的相似度均＞0.9，说明各产地药材的化学成分有较好的一致性，不同产地当归藤之间没有太大的差异，但各化学成分含量存在一定的差异。　　4.主成分分析显示不同产地当归藤样品可以分为两类：3个产地的当归藤为一类，其他的产地的当归藤为一类；　　5.与空白对照组大鼠相比，模型对照组大鼠血清中TXB2含量、TXB2/6-keto-PGF1α比值、PAI-1含量、cAMP水平升高（P＜0.01），6-keto-PGF1α含量、t-PA含量、t-PA/PAI-1比值下降（P＜0.01）；　　6.与模型对照组大鼠相比，当归藤不同极性提取物组可以降低大鼠血清中TXB2含量、PAI-1含量和cAMP含量；升高6-keto-PGF1α含量和t-PA含量，尤其是当归藤乙酸乙酯组和正丁醇组效果较为明显，差异具有统计学意义；　　7.环磷酰胺给药致使小鼠外周血中白细胞数，红细胞数，血红蛋白含量，血小板数等相应下降，说明血虚模型造模成功；　　8.与模型对照组小鼠比较，当归藤提取物各给药组中正丁醇组和水部位组可以明显升高环磷酰胺致血虚小鼠外周血中红细胞数、白细胞数、血红蛋白水平、红细胞比容水平和血小板数，差异有统计学意义；　　9.当归藤提取物各给药中正丁醇组和水部位组可以不同程度提高血虚小鼠中IL-3、EPO、G-CSF、M-CSF、VCAM-1等与造血功能有关的因子的含量，差异有统计学意义；　　10.当归藤提取物各给药组尤其是正丁醇组和水部位组可以不同程度提高血虚小鼠中IL-2、IL-6等与免疫功能有关的因子的含量，降低血虚小鼠脾脏指数，升高血虚小鼠的胸腺指数，差异有统计学意义。　　结论：1.所建的HPLC指纹图谱操作简单，方法稳定高效，且专属性强，可为后续进一步研究当归藤质量评价以及药效物质基础研究提供参考。2.当归藤不同极性提取物可显著增加环磷酰胺致血虚小鼠外周血红细胞、血小板的数量，提升血红蛋白的含量，并提高红细胞比容水平；3.当归藤能够不同程度地提高IL-2、IL-3、IL-6、EPO、G-CSF、M-CSF、VCMA-1等与造血功能相关的细胞因子的表达水平，说明当归藤具有补血作用。4.当归藤不同极性提取物可以增加大鼠血清中6-keto-PGF1α含量和降低血清中TXB2含量；5.当归藤不同极性提取物可以升高t-PA含量、降低PAI-1含量，维持血液中TXB2/6-keto-PGF1α的平衡，调节t-PA/PAI-1的平衡，纠正其平衡失调的作用，具有活血作用。

目录

声明

引言

第一部分 广西民族药当归藤指纹图谱的研究

1 实验药材、仪器与试剂

1.1 药材的来源

1.2 实验仪器

1.3实验药品与试剂

2 色谱及检测条件的选择

2.1 色谱柱的选择

2.2 流动相系统的选择

2.3 洗脱程序的选择

2.4 检测波长的选择

2.5 柱温和流速的选择

2.6 供试品溶液制备的考察

2.7 色谱系统适用性试验

2.8 色谱检测条件的确定

3方法学考察

3.1 供试品制备

3.2 对照品溶液制备

3.3 精密度实验

3.4 重复性试验

3.5 稳定性试验

4.1 空白试验

4.2 延长试验

4.3 参照色谱峰的建立

4.4参照峰的指认

4.5当归藤指纹图谱的采集

4.6指纹图谱和共有峰的确定

4.7 共有峰与非共有峰面积构成比

4.8 指纹图谱的相似度评价

4.9指纹图谱的聚类分析

4.10样品主成分分析（PCA）

5 讨论

5.1 非共有峰面积占的百分比较大

5.2提取方法的考察

5.3色谱柱以及流动相的考察

5.4 波长的选择

5.5 柱温、流速的选择

5.6 实验存在的不足

6 小结

第二部分 当归藤活血药效活性研究

1 材料

1.1实验药品

1.2 主要试剂

1.3 实验动物

1.4 仪器

2 实验方法

2.1 血瘀动物模型的复制

2.2动物分组

2.3给药方法

2.4成模标准

2.5检测物取材

2.6统计方法

3 观察项目

4 检测指标及检测方法

4.1 TXB2，6-keto-PGF1α，t-PA，PAI-1，cAMP的测定

4.2 酶联免疫法测定操作

5 实验结果

5.1 大鼠基本情况

5.2 对血淤模型大鼠血清TXB2、6-keto-PGF1α含量及TXB2/6-keto-PGF1α比值的影响

5.3 对血淤模型大鼠血清中t-PA、PAI-1含量的影响

5.4 对血淤模型大鼠血清中cAMP含量的影响

6 讨论

6.1关于当归藤提取物对血瘀大鼠模型血清中TXB2、6-keto-PGF1α的影响

6.2 关于当归藤提取物对血瘀形成大鼠血清中t-PA和PAI-1的影响

6.3 血淤动物模型的讨论

6.4 ELISA操作注意事项

7 小结

第三部分 当归藤补血药效学研究

1 材料

1.1 实验药品

1.2 实验主要试剂

1.3 动物和实验环境

1.4 仪器

2 实验方法

2.1 血虚动物模型的复制

2.2动物分组

2.3给药方法

2.4成模标准

2.5检测物取材

2.6统计方法

3 观察项目

4 检测指标及检测方法

4.1对造血功能的影响

4.2 IL-2，IL-6，IL-3，EPO，G-CSF，M-CSF，VCAM的测定

4.3 小鼠脏器指数的测定

5 实验结果

5.1 小鼠活动情况

5.2 对血虚模型小鼠外周血象的影响

5.3 对血虚模型小鼠血清IL-2含量的影响

5.4 对血虚模型小鼠血清IL-3含量的影响

5.5 对血虚模型小鼠血清IL-6含量的影响

5.6 对血虚模型小鼠血清中EPO含量的影响

5.7 对血虚模型小鼠血清中G-CSF含量的影响

5.8 对血虚模型小鼠血清中M-CSF含量的影响

5.9 对血虚模型小鼠血清中VCAM-1含量的影响

5.10 对血虚模型小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响

6 讨论

6.1外周血常规的检测

6.2对造血功能有关的因子的影响

6.3对血虚证动物免疫功能的影响

6.4 血虚动物模型的讨论

7 小结

第四部分 结论与展望

1 研究结论

2 展望

参 考 文 献

缩略词汇表

综述:中药补血作用研究进展

致谢

个人简介及攻读学位期间获得的科研成果