声明
摘要
致谢
第一章绪论
1．1．2GABA的生理功能及其应用
1．1．3GABA的制备
1．2谷氨酸脱羧酶
1．2．1GAD的催化机理
1．2．2GAD的结构特征
1．2．3GAD分子改造进展
1．3酶分子改造策略
1．3．1非理性设计
1．3．2理性设计
1．3．3半理性设计
1．4大肠杆菌中重组蛋白的表达调控策略
1．4．1选择合适的表达宿主
1．4．2优化培养条件
1．4．3调控转录过程
1．4．4调控翻译过程
1．5研究目的和主要研究内容
第二章基于多重序列比对和定点突变改造GAD热稳定性
2．1引言
2．2实验仪器与材料
2．2．1实验仪器
2．2．2菌株与质粒
2．2．3实验材料
2．3实验方法
2．3．1同源序列比对
2．3．2定点突交引物设计
2．3．3突变体的构建
2．3．4突变酶的诱导表达及分离纯化
2．3．5SDS-PAGE电泳分析
2．3．6酶的超滤浓缩
2．3．7纯化产物蛋白质浓度测定
2．3．8突变酶的初筛
2．3．9酶学性质的测定
2．3．10分子动力学模拟
2．4结果与讨论
2．4．1同源序列比对确定突变位点
2．4．2突变酶的表达和纯化
2．4．3突变酶的初筛
2．4．4突变酶H322R酶学性质的进一步考察
2．4．5分子动力学模拟及构效关系分析
2．5本章小结
3．1引言
3．2实验仪器与材料
3．2．1实验仪器
3．2．2菌株与质粒
3．2．3实验材料
3．3实验方法
3．3．1H322位点的共进化网络分析
3．3．2饱和突变文库的构建
3．3．3饱和突变文库的初筛与复筛
3．3．4突变酶的诱导表达及分离纯化
3．4．1H322位点的共进化网络分析
3．4．2饱和突变文库的初筛与复筛
3．4．3突变酶的SDS-PAGE分析
3．4．4酶学性质的测定
3．4．5分子动力学模拟及构效关系分析
3．5本章小结
第四章引入同义突变改变mRNA的N端序列提高GAD表达水平
4．1引言
4．2实验仪器与材料
4．2．1实验仪器
4．2．2首株与质粒
4．2．3实验材料
4．3实验方法
4．3．1GAD mRNA二级结构自由能计算
4．3．2定点突变引物设计
4．3．3突变体的构建
4．3．4突变体的诱导表达
4．4．1N端mRNA二级结构分析
4．4．2PCR产物的电泳分析
4．4．3N端mRNA序列改造效果
4．4．4讨论
4．5本章小结
5．1总结
5．2展望
参考文献
浙江大学;
