萝卜硫素通过调节氧化应激和内质网应激保护鸡胚血管发育

摘要

我们先前的研究表明，酒精暴露会过度地刺激活性氧(ROS)生成，从而抑制胚胎血管生成。在本研究中，我们用鸡胚血管发育模型，探究了萝卜硫素作为一种已知的饮食中的生物活性化合物，是否可以改善酒精抑制的血管生成。利用鸡胚卵黄膜(yolk sac membrane)和绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane)血管发育模型，我们的实验结果表明单独施加低浓度的萝卜硫素(2.5至10μM)可以增加血管生成，但是高浓度的萝卜硫素(20至40μM)则会抑制血管生成。在以上两种血管发育模型中，我们均发现萝卜硫素给药可以缓解酒精抑制的血管生成，并能调节血管生成相关基因的表达。此外，我们的研究结果显示酒精暴露会引起鸡胚绒毛尿囊膜细胞凋亡，而同时施加萝卜硫素可以缓解细胞凋亡。随后，我们证明了萝卜硫素可以在一定程度上挽救酒精诱导的ROS产生的增加以及抗氧化酶活性的降低。通过检测ATF6和GRP78的表达，并利用毒胡萝卜内酯特异性诱导内质网应激的实验，我们还发现萝卜硫素处理之后，酒精诱导的内质网应激激活也得到了一定程度的恢复。总之，我们的实验结果显示，萝卜硫素给药可以改善酒精抑制的胚胎血管生成，这种保护作用主要是通过缓解过度的ROS生成和内质网应激来实现的。本研究表明，适当浓度的萝卜硫素可能是一种预防酒精对血管生成的负面影响的潜在候选化合物。

目录

声明

目 录

1 前言

1.1 胚胎早期血管发育

1.1.1 血管新生（Vasculogenesis）

1.1.2 血管生成（Angiogenesis）

1.2 血管发育的相关基因调控

1.2.1 血管新生的基因调控

1.2.2 血管生成的基因调控

1.2.3 血管成熟的基因调控

1.3 胎儿酒精综合症与血管发育异常

1.4 酒精暴露导致血管发育异常的机制研究

1.4.1 酒精诱导的氧化应激与血管发育的关系

1.4.2 内质网应激与氧化应激的关系

1.5 萝卜硫素的生物学效应

1.6 研究目的和意义

2 实验材料与实验方法

2.1 实验动物

2.2 主要试剂和仪器

2.3 主要试剂的配制

2.3.1免疫印迹（western blot）相关试剂的配制

2.3.2 免疫荧光（Immunofluorescence，IF）相关试剂的配制

2.3.3 细胞培养相关试剂的配制

2.3.4 苏木素-伊红染液的配制

2.3.5 其它试剂的配制

2.4 实验方法

2.4.1 鸡胚绒毛尿囊膜模型（CAM）的建立

2.4.2 鸡胚胎体外培养并卵黄囊膜（YSM）单侧给药模型的建立

2.4.3 石蜡包埋和切片

2.4.4 苏木素-伊红染色

2.4.5 免疫荧光（Immunofluorescence，IF）染色

2.4.6 蛋白质免疫印迹实验（western blot，WB）

2.4.7 总RNA的提取和荧光定量PCR检测（quantitative PCR，qPCR）

2.4.8 凋亡细胞TUNEL染色

2.4.9 DCFH-DA法检测细胞内ROS水平

2.4.10 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡

2.4.11 T-SOD、GSH、GSSG、MDA、ADH和ALDH活力和含量的测定

2.4.12 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的培养

2.4.13内皮细胞成管实验（Tube formation assay）

2.5 统计学分析

2.6 研究路线

3 实验结果

3.1 萝卜硫素会双向影响鸡胚的血管生成

3.2 萝卜硫素能以时间和剂量依赖性的方式挽救乙醇抑制的胚胎血管生成

3.3 萝卜硫素可以挽救乙醇诱导的鸡胚绒毛尿囊膜细胞凋亡

3.4 萝卜硫素可缓解乙醇诱导的鸡胚绒毛尿囊膜的氧化应激和内质网应激

3.5 萝卜硫素保护乙醇诱导的病理性血管生成机制的模式图

讨论

总结

参考 文献

英文缩略词表索引

在校期间发表论文清单

致谢