铜对酿酒酵母响应百草枯胁迫的调节作用

摘要

百草枯(PQ)是一种广谱有机杂环类除草剂，对人和动物具有剧毒，且无有效的治疗手段和药物。铜作为一种具有氧化还原活性的金属元素，不但是大多数活细胞的重要组成元素，而且作为辅因子参与多种酶结构和酶代谢反应的发生。为探索酿酒酵母对PQ胁迫的应激反应及分子机制，以及铜在酵母细胞响应PQ胁迫的过程中发挥的作用，本研究选用真核模式生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为研究对象，利用细胞毒性检测、流式细胞仪检测PQ胁迫下菌体细胞呼吸活性的变化；利用DIA蛋白质组学手段研究了PQ胁迫下，菌体蛋白质表达水平和代谢网络的变化。　　结果表明，低浓度百草枯胁迫下，铜增强细胞抗应激的能力。百草枯的存在引起了电子传递链相关酶的活性的增加。在0.7mM百草枯胁迫下，铜浓度为0.4mM时，细胞存活率更高，但是细胞的呼吸活性降低。　　DIA蛋白质组学结果表明，铜浓度升高后，酵母细胞的磷酸戊糖途径被抑制，生成的NADPH降低；刺激免疫系统结合信号传导的反应；催化硫化物的生成和半胱氨酸的合成；刺激核糖体中多肽合成，抗氧化蛋白的表达增加。铜降低PQ通过NADPH-细胞色素P450还原酶对细胞产生的活性氧与毒害作用。　　百草枯对酿酒酵母蛋白表达的影响结果表明百草枯胁迫下炎症反应所致损伤、纤维化与细胞钙调磷酸酶的活性和蛋白RCANs下调有关。蛋氨酸和精氨酸的合成是其抵御百草枯毒性的机制，但却导致一氧化氮释放的增加，纤维化的情况越来越严重。百草枯破坏了细胞囊泡输运机制，还影响着网格蛋白介导的胞吞作用。细胞发生过度的自噬，然而自噬后期的自噬体-溶酶体融合过程受到影响，会引起自噬性细胞死亡。MAPKHog1高渗透压生长途径引起过氧化氢酶CTT1表达上调是有利于酵母免受PQ引起的过氧化氢的伤害。而蛋白Sic1抑制了酵母细胞进入有丝分裂和减数分裂的起始点和DNA复制的起点。而且细胞无法维护端粒，DNA受到严重的损伤。PQ会引起对细胞有毒的未折叠蛋白质积累和聚集，造成内质网应激。　　铜对百草枯胁迫下酿酒酵母蛋白质表达的影响结果表明在铜离子为0.4mM时，百草枯胁迫会使菌体的嘌呤代谢紊乱，产生过量的强抗氧化剂尿酸来应对胁迫。抑制了醛脱氢酶的表达，导致氧化性强的醛类物质对细胞持续的胁迫；抑制着糖原和糖的降解，NADPH的生成受到抑制，不利于为细胞提供能量。百草枯刺激细胞呼吸链，导致超氧化物的产生。在百草枯胁迫下，铜抑制细胞通过呼吸链产生大量的活性氧，但是也因此抑制了ATP生成，不利于细胞的存活。铜浓度增加导致烟酸、NAD和NADP的合成减少。铜抑制着细胞能量的产生以及还原势的利用与产生，是对百草枯导致的连续性氧化还原反应的阻断方式。但是铜导致在百草枯胁迫阶段细胞内烟酰胺的积累，以及长寿调节途径中相关蛋白的表达显著下调，都是不利于细胞寿命的延长，会引起细胞自噬。百草枯胁迫下，铜还抑制了细胞核孔交换过程，促进了细胞的翻译过程。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 百草枯的概况

1.1.1 百草枯的应用和在环境中的残留现状

1.1.2 百草枯的毒性

1.1.3 百草枯的缓解与治疗

1.2 毒理蛋白质组学研究现状

1.2.1 毒理蛋白质组简介

1.2.2 DIA在毒理和机制研究中的应用

1.3 本论文研究工作

1.3.1 研究目的

1.3.2 研究内容

1.3.3 技术路线

1.3.4 研究创新点

第2章 铜对百草枯抑制酵母生长的影响

2.1 实验材料与设备

2.1.1 菌种与试剂

2.1.2 培养基

2.1.3 实验设备

2.2 实验方法

2.2.1 菌种培养

2.2.2 实验方案

2.2.3 不同铜浓度下酿酒酵母的生长曲线

2.2.4 百草枯对酿酒酵母生长抑制曲线

2.2.5 细胞毒性测定

2.2.6 细胞呼吸活性检测

2.3 结果与讨论

2.3.1 生长抑制曲线

2.3.2 细胞毒性

2.3.3 酿酒酵母细胞呼吸活性

2.4 本章小结

第3章 DIA全蛋白分析铜对酵母细胞百草枯毒性的作用机制

3.1 实验试剂与仪器

3.1.1 实验试剂

3.1.2 仪器设备

3.2 实验方法

3.2.1 蛋白提取与质检

3.2.2 蛋白酶解与除盐

3.2.3 高效液相色谱进行DDA样品分离

3.2.4 高分辨质谱DDA模式建库

3.2.5 高分辨质谱DIA模式分析

3.2.6 蛋白鉴定与数据分析

3.2.7 生物信息学分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 蛋白鉴定结果与质量评估

3.3.2 铜对酿酒酵母蛋白质表达的影响

3.3.3 百草枯对酿酒酵母蛋白表达的影响

3.3.4 铜对百草枯胁迫下酿酒酵母蛋白质表达的影响

3.4 本章小结

第4章 结论与展望

4.1 主要结论

4.2 不足与展望

参考文献

在校期间发表的论文

致谢