ATP诱导NLRP3炎症小体途径受阻的巨噬细胞发生焦亡的机制研究

摘要

目的：　　ATP是NLRP3炎症小体的经典激动剂之一，可诱导巨噬细胞通过Caspase-1/GasderminD(GSDMD)途径发生焦亡。然而，在因病原体的感染而导致NLRP3炎症小体活化受阻的巨噬细胞中，ATP能否诱导细胞发生焦亡，目前尚不明确。本课题利用ASC缺陷的RAW264.7细胞系及NLRP3炎症小体特异性抑制剂MCC950预处理的骨髓源性的巨噬细胞(BMDM)作为体外细胞模型，再用ATP对细胞进行刺激，探究当巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化受阻时细胞的死亡方式。　　方法：　　由于细胞发生焦亡(一种裂解性死亡)时会发生明显的形态学变化，细胞会发生肿胀，最终导致胞膜破裂及细胞内容物释放，因此可用碘化丙锭(PI)染色法检测BMDM及RAW264.7细胞的裂解性死亡；进一步采用免疫印迹法检测上述两种细胞模型上清中Caspase-1、IL-1β的表达水平，以及细胞裂解物中pro-Caspase-1、pro-IL-1β、GSDMD、GasderminE(GSDME)以及凋亡相关的Caspases蛋白的表达水平；利用特异性抑制剂DEVD抑制Caspase-3的活性，或siRNA敲低Caspase-3、GSDME的表达，进而采用PI及免疫印迹法检测细胞坏死率及焦亡通路相关蛋白的表达水平。　　结果：　　ATP可时间依赖性诱导RAW264.7细胞及NLRP3炎症小体活化受阻(MCC950处理)的BMDM细胞发生裂解性死亡，但不引起NLRP3炎症小体活化介导的焦亡经典途径中Caspase-1及GSDMD的活化，却可引起凋亡相关的启动蛋白Caspase-8和Caspase-9以及凋亡相关的执行蛋白Caspase-7和Caspase-3的活化，最终引起GSDME蛋白的活化，诱导细胞发生Caspase-3/GSDME途径依赖的裂解性死亡；Caspase-3特异性的抑制剂DEVD可降低ATP诱导的细胞死亡率，并下调GSDME蛋白的活化；与此同时，siRNA敲低GSDME可降低ATP诱导的细胞死亡率及HMGB1蛋白在上清中的分泌水平。siRNA敲低Caspase-3可降低ATP诱导的细胞死亡率。　　结论：　　当机体组织损伤或受到感染时，ATP作为常见的损伤相关的分子模式，可在NLRP3炎症小体活化受阻时，通过Caspase-3/GSDME途径诱导巨噬细胞发生焦亡，提示另一种潜在的宿主对抗病原体逃逸的细胞焦亡机制。

目录

声明

1 前言

1.1 巨噬细胞

1.2 NLRP3炎症小体与ATP

1.3细胞焦亡

1.4 细胞凋亡

1.5 本课题的研究意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要实验仪器仪器名称

2.1.4 主要试剂配方

2.2 实验方法

2.2.1 RAW 264.7细胞及J774A.1细胞的培养

2.2.2 骨髓源性巨噬细胞（BMDM）的诱导分化与培养

2.2.3细胞焦亡的表象检测实验

2.2.4 蛋白质的提取与收集

2.2.5 免疫印迹分析

2.2.6 GSDME/Caspase-3/NLRP3的敲低

2.2.7 统计学分析

3. 结果

3.1 ATP在NLRP3炎症小体活化受阻的BMDM中诱导细胞发生不同于经典途径的细胞焦亡

3.2 ATP诱导ASC缺陷的RAW 264.7细胞发生延迟性的细胞焦亡

3.3 Caspase-3参与巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化受阻时ATP诱导的细胞焦亡

3.4 敲低GSDME可部分削弱ATP诱导的细胞焦亡

4 讨论

5 全文总结

参考文献

附录I 英文缩略词

附录Ⅱ 在校期间发表论文清单

致谢