高同型半胱氨酸血症与缺血性脑小血管病的关系及炎性机制探讨

摘要

背景　　全球疾病负担研究显示，脑卒中在2010年已经成为中国首位致死病因，其致死率、致残率高,严重影响患者生活质量，给患者个人、家庭和社会带来沉重的负担。我国目前已有1300万脑卒中患者，其中约75%是缺血性脑卒中。缺血性卒中最常见的就是缺血性脑小血管病(cerebral small vessel disease，CSVD)，包括腔隙性脑梗塞(lacuna infarction，LI)和缺血性脑白质病变(White matter lesion，WML)。随着计算机断层成像(CT)和核磁共振(MR)成像等技术的普及应用，大量的CSVD被发现。近年来对CSVD的病因、发病机制、临床和影像研究都取得了很大进展。流行情况调查显示：亚洲人有较高的CSVD负担，且CSVD风险随着年龄的增长而增加。把CSVD做为临床预防和治疗的重要目标，以减少CSVD带来的严重家庭和社会负担。　　高同型半胱氨酸血症(hyperhomocystinemia，HHcy)是指血浆或血清中游离及与蛋白结合的同型半胱氨酸和混硫化物含量增高，由甲硫氨酸代谢障碍引起。同型半胱氨酸(Hcy)是脑血管疾病的重要危险因素，脑血管病的病理基础是动脉粥样硬化，但HHcy与脑大、小动脉硬化的关系存在较多争议。国内报道HHcy与颅内外大动脉硬化狭窄及狭窄程度增加有关。国外报道，HHcy只对脑小血管缺血有重要影响，而非作用于大动脉。我们在临床中发现HHcy与脑大、小动脉病变均有密切关系。研究认为HHcy可通过炎症反应导致动脉粥样硬化，加速动脉粥样硬化的进程，增加缺血性中风的风险。高敏C反应蛋白(Hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)是临床常用炎性指标，其在动脉粥样硬化的炎症过程中起重要作用，是判断动脉粥样硬化性脑梗死风险和预后的高敏感指标。hs-CRP可通过激活炎性反应，引发氧化应激等，损伤血管内皮细胞。内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化和血管疾病的早期指标和初始机制，内皮细胞功能损伤会诱发血管硬化和平滑肌细胞异常增殖。对HHcy引起血管内皮细胞损伤的确切机制尚未明确。研究显示：HHcy增加了主动脉外膜的炎症，其通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-1)依赖的炎症导致内皮细胞功能障碍。但HHcy通过炎性反应升高，损伤血管内皮细胞功能，导致缺血性CSVD发生的具体机制还不清楚，值得我们进一步去研究，以便指导在临床上制定适当的干预策略。　　目的　　1、研究HHcy对动脉粥样硬化(颈动脉斑块、内-中膜厚度(ntima-mediathickness，IMT)、颈/颅内动脉狭窄)的影响；　　2、研究HHcy对缺血性CSVD(LI和WML)的影响；　　3、缺血性CSVD、IMT增厚和颈动脉不稳定斑块患者中hs-CRP的情况；　　4、研究HHcy引起小鼠颈动脉增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表达、血清炎性因子(白细胞介素1β(interleukin1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6))释放和小鼠脑血管Caspase-1表达的情况，探索HHcy通过引起促炎因子释放加重炎症反应；　　5、进一步研究HHcy引起Nod样受体蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3，NLRP3)炎症小体激活与对血管内皮细胞功能损伤的关系。　　方法　　选取153名于2017.1-2018.02我院神经内科住院患者和同期1357名我院体检科的中老年体检者进行研究，根据年龄、性别分组后，比较Hcy与年龄、性别和绝经的关系；对小血管闭塞(LI)组的Hcy和体检组/非卒中住院患者进行比较；根据Fazekas分级对缺血性WML评分，并根据WML严重程度分组，对不同组的Hcy比较，探讨Hcy与WML严重程度的影响；对颈/颅内动脉狭窄组的Hcy和非狭窄组，颈动脉不稳定斑块组的Hcy和无斑块组进行比较；IMT≥1组的Hcy和IMT正常组比较，研究HHcy对大动脉粥样硬化的影响；腔梗和非卒中对照组的hs-CRP比较；对不同严重程度WML组(Fazekas0-1组和4-6分组)之间，不稳定斑块组和无斑块组之间hs-CRP的比较，研究hs-CRP对动脉硬化和WML的影响。　　机制探讨方面，应用C57BL/6J雄性小鼠灌胃1.5%蛋氨酸饲料制备HHcy小鼠模型，模型制备8周后利用酶联免疫吸附法对血清炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-6水平进行检测，并利用免疫组化方法检测小鼠颈动脉PCNA表达，用免疫荧光法检测脑血管Caspase-1表达，用免疫印迹法检测脑血管内皮素-1(endothelin-1，ET-1)、Caspase-1表达。同时利用HHcy刺激人微血管内皮细胞株-1(human microvascular endothelial cells-1，HMEC-1)24小时后。用免疫印迹法检测细胞上清IL-1β、Caspase-1的含量。检测Hcy处理HMEC-1细胞后，细胞内ET-1、血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、NLRP3、核因子κBp65(NuclearFactorκBp65，NF-κBp65)、pro-Caspase-1、Caspase-1的蛋白含量。　　结果　　1、颈部/颅内动脉狭窄组相较无狭窄组的Hcy显著升高(P＜0.05)；IMT≥1患者较IMT正常组的Hcy显著高(P＜0.05)；　　2、Fazekas2-3分WML组的Hcy显著高于0-1分组(P＜0.05)；Fazekas4-6分的WML的Hcy显著高于2-3分组(P＜0.05)；LI组的Hcy显著高于体检组(p＜0.05);LI组相较住院非卒中患者组的Hcy显著升高(P＜0.05)；　　3、LI组相较非卒中患者的hs-CRP显著高(P＜0.05)；Fazekas4-6分WML的hs-CRP较Fazekas0-1分的WML显著升高(P＜0.05)；不稳定斑块组的hs-CRP较无斑块组的显著升高(p＜0.05)。　　4、HHcy模型组小鼠的血清中IL-1β，TNF-α和IL-6蛋白水平升高,其中以IL-1β升高最为明显；HHcy模型组小鼠的脑血管Caspase-1表达升高；HHcy模型组小鼠颈动脉Caspase-1表达升高；HHcy增加HMEC-1细胞上清中IL-1β，Caspase-1含量；HHcy降低HMEC-1细胞的活力，LDH释放增加；HHcy降低HMEC-1细胞ET-1和VCAM-1表达，增加细胞浆NLRP3，Caspase-1的水平，同时增加细胞核NF-κBp65蛋白表达。　　结论　　HHcy可通过增加炎症反应，引起或加重IMT增厚、颈动脉不稳定粥样斑块、颈/颅内动脉狭窄的发生/发展，最终导致缺血性CSVD的发生。我们要重视HHcy预防和治疗，降低缺血性CSVD(IL、WML)发生，炎性反应可作为干预缺血性CSVD的靶点之一，HHcy引起缺血性CSVD的血管内皮损伤炎性机制值得进一步深入研究。　　我们的研究发现：HHcy通过激活NF-κB信号通路，增加pro-IL-1β及pro-Caspase-1的表达；同时增加NLRP3的表达，活化NLRP3炎性小体，增加血管内皮细胞Caspase-1的含量，从而释放具有活性的IL-1β。促炎性因子IL-1β，IL-6，TNF-α的协同作用，促进血管内皮细胞炎症发生和发展，导致血管内皮细胞损伤(内皮细胞活力下降，LDH释放增加)，颈动脉内皮细胞PCNA阳性细胞数目增多(血管平滑肌细胞可能过度增殖)，血管重构(IMT增厚，斑块形成，动脉狭窄)，引起或加重动脉硬化，最终产生缺血性脑小血管病(LI、WML)。针对炎症源头NLRP3炎性小体激活的干预措施可能有助于预防或治疗HHcy引起的缺血性CSVD。

目录

声明

引言

第一部分 高同型半胱氨酸血症与缺血性脑小血管病关系的临床研究

前言

材料与方法

1 研究对象

2方法

3技术路线

4结果

5讨论

6小结

参考文献

第二部分 高同型半胱氨酸引起血管内皮细胞损伤的炎性机制研究

引言

材料与方法

1材料

2方法

3研究路线

4结果

5讨论

6小结

参考文献

结论

附图

缩略词中英文对照表

读博期间以第一作者或通讯作者身份发表的论文

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