TAT通过靶向PAC1-R的正向别构调节增强VIP在MPTP帕金森模型中的神经保护作用

摘要

目的：帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是仅次于阿尔茨海默病的第二大神经退行性疾病，主要表现为震颤，僵硬，运动迟缓和步态障碍，其症状主要是由于纹状体多巴胺(Dopamine，DA)含量降低所致。PD患者在发展出临床运动功能障碍之前有严重的纹状体多巴胺细胞丢失，如果能阻止或延缓神经元的丢失将是极为有益的。本课题组已有报道表明细胞穿膜肽TAT(YGRKKRRQRRR)连接血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide，VIP)后形成的VIP-TAT在小鼠记忆损伤模型中具有神经保护作用。我们推测VIP-TAT在PD模型中也具有神经保护作用。因此，研究目的是探索VIP-TAT在动物和细胞PD模型中的神经保护作用。　　方法：本研究首先利用1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)建立帕金森症细胞模型，在此基础上通过活力实验、DA含量检测、多巴胺转运蛋白(Dopamine transporter，DAT)含量检测、Tunel染色法、Caspase3活性检测探究VIP-TAT对Neuro2a细胞的保护作用。然后利用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)建立帕金森症动物模型，而后通过悬挂实验、爬杆实验、DA及其代谢物含量检测、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活力检测探究VIP-TAT对PD动物模型的神经保护作用。然后利用等温滴定量热法(Isothermal titration calorimetry，ITC)检测VIP-TAT/VIP与垂体腺苷酸环化酶激活多肽I型受体(PAC1-R)N端胞外域(PAC1-EC1)的亲和力，并利用高表达PAC1-R的PAC1-CHO细胞比较了VIP-TAT和VIP对cAMP积累量的影响。最后为了对具有相似神经保护作用的VIP-TAT和垂体腺苷酸环化酶激活多肽-38(Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38，PACAP38)进行比较，研究分析了两者对ERK的磷酸化水平，以及两者在血清中的稳定性。　　结果：1)VIP-TAT和PACAP38能显著抑制MPP+诱导的细胞活力降低，并且其作用显著高于VIP；VIP-TAT和PACAP38在抑制MPP+诱导的DA和DAT水平降低上比VIP发挥更有效的作用；VIP-TAT和PACAP38的抗凋亡作用显著高于VIP。2)VIP-TAT和PACAP38预处理可显著抑制MPTP诱导小鼠悬挂评分和爬杆时间的降低，其作用显著高于VIP；VIP-TAT的预处理能显著抑制MPTP诱导的小鼠纹状体DA及其代谢物含量的下降，其作用显著高于VIP和PACAP38；VIP-TAT和PACAP38的预处理能显著抑制MPTP诱导的小鼠大脑的SOD活力下降，其作用显著高于VIP。3)VIP-TAT对PAC1-EC1(Ka=3.09E5±4.07E4M-1)具有亲和力，并且该亲和力高于VIP对PAC1-EC1(Ka=2.92E3±1.53E2M-1)的亲和力；PACAP38(Ka=1.41E6±5.77E5M-1)对PAC1-EC1的亲和力略高于PACAP27(Ka=1.10E6±1.17E5M-1)；VIP-TAT诱导cAMP蓄积的EC50为0.63nM，约为VIPEC5067.6nM的1/100；PACAP38不仅具有比VIP-TAT低的EC50，而且具有比VIP-TAT(约为PACAP27的80％)更高的最大效力(约为PACAP27的110％)。4)PACAP38和VIP-TAT均可诱导ERK1/2磷酸化，VIP-TAT在1-100nM浓度时与PACAP38有相似的刺激作用，而在1000nM及以上浓度条件时，VIP-TAT的刺激作用下降幅度大于PACAP38；血清稳定性分析中，PACAP38在5min内完全降解，而30min后仍能检测到VIP-TAT。　　结论：本研究表明VIP-TAT对PD动物和细胞都有神经保护作用，并且其保护能力是强于VIP而与PACAP38相似。可能原因是(1)TAT模仿PACAP(28-38)的正向别构调节剂效应增加了对PAC1-R的结合与激活能力；(2)TAT的连接使得VIP的富含精氨酸的阳离子多肽(Cationic Arginine-Rich Peptides，CARPs )特性得到增强。此外，TAT作为CARPs的一成员，它能与PAC1-EC1中正向别构调节剂位点结合，因此PAC1-R可能成为CARPs的又一新靶点。

目录

声明

英文缩略表

第1章 前 言

1.1 帕金森病

1.1.1 帕金森的概述

1.1.2 PD治疗

1.1.3 PD细胞模型和动物模型

1.2 血管活性肠肽 VIP

1.3 垂体腺苷酸环化酶激活多肽受体1 PAC1-R

1.4 TAT与PACAP（28-38）

1.5 富含精氨酸的阳离子多肽 CARPs

1.6 VIP-TAT介绍

1.7 GPCRs的别构调节

1.8 本实验研究目的、意义及内容

1.8.1 本研究的目的及意义

1.8.2 本研究的主要内容

第2章 VIP-TAT在MPP+诱导的PD细胞模型中的神经保护作用

2.1 实验背景介绍

2.2 实验方法

2.2.1 MTT法检测VIP-TAT对MPP+诱导PD细胞模型的保护作用

2.2.3 Tunel 染色

2.2.2多巴胺与多巴胺转运蛋白的检测

2.2.4 Caspase 3 的活性检测

2.2.5 统计学分析

2.3 实验结果

2.3.1 VIP-TAT对MPP+诱导的PD细胞活力的影响

2.3.2 VIP-TAT对MPP+诱导的PD细胞中DA含量的影响

2.3.3 VIP-TAT对MPP+诱导的PD细胞中DAT含量的影响

2.3.4 VIP-TAT对MPP+诱导的PD细胞的Tunel染色影响

2.3.5 VIP-TAT对MPP+诱导的PD细胞中Caspase-3活性的影响

2.4 讨论

2.5 本章小结

第3章 VIP-TAT在MPTP诱导的PD动物模型中的神经保护作用

3.1实验背景

3.2 实验方法

3.2.1 动物与药物治疗

3.2.2 悬挂测试

3.2.3 爬杆测试

3.2.4 组织准备

3.2.5 纹状体中DA及其代谢物水平的检测

3.2.6 抗氧化活性分析

3.2.7 统计学分析

3.3. 实验结果

3.3.1 VIP-TAT对小鼠体重的影响

3.3.2 VIP-TAT对小鼠悬挂得分的影响

3.3.3 VIP-TAT对小鼠爬杆的影响

3.3.4 VIP-TAT对小鼠纹状体中DA及其代谢物含量的影响

3.3.5 VIP-TAT对小鼠大脑SOD活性的影响

3.4 讨论

3.5 本章小结

第4章 TAT增强VIP对PAC1-R的亲和力和激活作用

4.1 实验背景

4.2 实验方法

4.2.1 等温滴定量热法（ITC）

4.2.2 环磷酸腺苷酸（cAMP）积累实验

4.2.3 多肽净电荷计算

4.2.4 统计学分析

4.3 实验结果

4.3.1 TAT增强VIP对PAC1-EC1的亲和力

4.3.2 TAT增强VIP对PAC1-R的激活

4.4 讨论

4.5 本章小结

第5章 VIP-TAT与PACAP38的比较

5.1 实验背景

5.2 实验方法

5.2.1 Western blot分析ERK磷酸化

5.2.2 多肽稳定性测定

5.2.3 统计学分析

5.3 实验结果

5.3.1 VIP-TAT和PACAP38刺激ERK磷酸化能力的比较

5.3.2 VIP-TAT和PACAP38在血清中稳定性的比较

5.4 讨论

5.5 本章小结

第6章 总结、创新性及展望

6.1 总结

6.2 创新性

6.3 展望

第7章 实验主要仪器试剂和技术

7.1 主要仪器

7.2 主要实验材料及试剂

7.3 实验主要试剂配方

（1）PBS

（2）Tris-HCl（pH7.4）（20mM）

（3）MTT（5mg/mL）

7.4.1 细胞培养技术

7.4.2 BCA 法测蛋白浓度

参考文献

攻读硕士期间发表论文

致谢