转录因子EGR1-miR-203a-靶基因(WT1/Bmi-1/XIAP)调控网络影响慢性粒细胞白血病K562细胞的增殖机制

摘要

目的：　　本研究结合生物信息学探讨miR-203a调控网络在CML发生发展中的作用，为CML发生分子机制提供新的理论依据，为CML的靶基因治疗提供新的干预策略。　　方法：　　1.采用生信分析软件预测获得调控miR-203a的转录因子EGR1和miR-203a的靶基因WT1、Bmi-1和XIAP；2.采用qRT-PCR技术检测病人外周血及K562细胞中检验EGR1、miR-203a和靶基因(WT1/Bmi-1/XIAP)的表达情况；3.利用5’Race和CHIP实验确认miR-203a的转录起始位点以及EGR1与miR-203a启动子序列的结合位点；4.采用双荧光素酶报告基因验证miR-203a与靶基因(WT1/Bmi-1/XIAP)的相互作用；5.采用RNA小分子模拟物、干扰RNA、载体质粒的构建等技术研究EGR1、miR-203a和靶基因的三者之间的表达调控；MTT法和Brdu染色增殖法检测细胞的增殖及活性；qRT-PCR和Westernblot检测三者表达量的变化。　　结果：　　1.在初发慢性粒细胞白血病病人外周血和K562细胞中验证与生物信息学预测结果一致，与对照组相比，转录因子EGR1和miR-203a表达下调，靶基因WT1、Bmi-1和XIAP表达显著增强。　　2.生物信息学预测结果显示，早期生长转录因子1(EGR1)作为调节miR-203a的转录因子，在miR-203a启动子区域存在其结合位点，进一步5’Race实验验证表明，miR-203a的转录起始位点是茎环上游339bp处的G碱基。CHIP实验表明转录因子EGR1与miR-203a在其启动子上游268bp处结合。　　3.双荧光素酶报告基因结果显示，miR-203a组与对照组相比，荧光素酶活性显著降低；miR-203a可与靶基因(WT1/Bmi-1/XIAP)的3’UTR结合。　　4.K562细胞转染miR-203aminics,使miR-203a在细胞中有效过表达。与对照组相比，在miR-203a过表达组的mRNA和蛋白水平，转录因子EGR1表达上调，靶基因(WT1/Bmi-1/XIAP)表达显著下调。　　5.在K562细胞中转染构建的EGR1质粒载体，与对照组相比，miR-203a协同性表达上调，从而导致靶基因(WT1/Bmi-1/XIAP)表达显著下调；转染si-EGR1，敲低EGR1表达，与对照组相比，miR-203a表达随之降低，导致靶基因(WT1/Bmi-1/XIAP)表达显著增强。　　6.在K562细胞中转染靶基因(WT1/Bmi-1/XIAP)的siRNA，敲低靶基因的表达，与对照组相比，靶基因的表达有效下调，均可导致miR-203a表达显著增加。　　7.MTT结果显示,与对照组相比，在K562细胞中转染miR-203aminics，可使细胞活性显著减弱；Brdu染色增殖实验显示，过表达miR-203a组的Brdu阳性率为显著降低，抑制细胞DNA的复制。　　8.MTT结果显示，在K562细胞中转染靶基因(WT1/Bmi-1/XIAP)质粒载体，可显著增强细胞活性，miR-203a和靶基因质粒载体共转染，细胞活性显著降低，过表达靶基因(WT1/Bmi-1/XIAP)可抵消了miR-203的抑癌作用。　　结论　　在慢性粒细胞白血病K562细胞中，EGR1低表达并通过EGR1-miR-203a-WT1/Bmi-1/XIAP信号轴上调靶基因WT1，BMI1，XIAP的表达，进而影响K562细胞增殖及活性。

目录

声明

前言

1.慢粒的研究现状

2. microRNA的功能和作用机制

3.miR-203a

4.转录因子EGR1和靶基因（WT1/Bmi-1/XIAP）

5.研究假说和研究思路

6.技术路线图7.研究意义及创新之处

7.研究意义及创新之处

第一部分 生物信息学预测在CML中调节miR-203a的转录因子及miR-203a作用的靶基因

1.材料和方法

1.1 预测及筛选调控miR-203a的转录因子

1.2 miR-203a的靶基因预测

2.结果

2.1预测获得在CML中调节miR-203a的转录因子EGR1

2.2预测获得在CML中miR-203a作用的三个靶基因WT1/Bmi-1/XIAP

3.讨论

第二部分 探究转录因子EGR1-miR-203a-靶基因（WT1/Bmi-1/XIAP）三者在CML发生发展中的调控作用

1.材料

1.1细胞

1.2主要仪器

1.3 实验试剂

1.4主要的试剂配制

1.5引物的设计

1.6病人资料

2.实验方法

2.1细胞培养

2.2 qRT-PCR检测miR-203a、转录因子和靶基因的表达水平

2.3 5’端cDNA快速扩增实验（5’RACE）

2.4染色质免疫沉淀实验（CHIP）

2.5双荧光素酶实验

2.6 质粒及siRNA合成

2.7细胞转染

2.8 MTT检测细胞的增殖

2.9 Brdu染色

2.10蛋白质免疫印迹法检测目标蛋白的表达

3.结果

3.1 miR-203a、EGR1和靶基因(WT1/Bmi-1/XIAP)在外周血白细胞和K562中的mRNA表达水平检测

3.2 检测miR-203a的转录起始位点

3.3 转录因子EGR1与miR-203a的启动子结合

3.4 miR-203a和靶基因（WT1/Bmi-1/XIAP）的结合

3.5构建miR-203a过表达K562细胞

3.6过表达miR-203a对EGR1和靶基因（WT1/Bmi-1/XIAP）在mRNA和蛋白表达水平的影响

3.7 EGR1对miR-203a和靶基因（WT1/Bmi-1/XIAP）在mRNA和蛋白水平的影响

3.8 靶基因siRNA对miR-203a表达水平的影响

3.9 miR-203a对K562细胞增殖及活性的影响

3.10MTT检测过表达miR-203的K562细胞中共转染pcDNA3.1(﹢) WT1/Bmi-1/XIAP之后的细胞增殖及活性

4.讨论

4.1EGR1

4.2靶基因（WT1/Bmi-1/XIAP）

结论

参考文献

附录

在读期间科研成果

致谢