中国鳅类DNA条形码研究

摘要

近年来，受水体污染、水资源枯竭、无节制捕捞等因素影响，我国的淡水鱼类资源受到严重破坏，一些种类濒危乃至正遭受灭顶之灾，亟需采取有效措施加以养护。鳅类(Loaches )隶属鲤形目(Cypriniformes )，是条鳅亚科(Noemacheilinae )、花鳅亚科(Cobitinae)、沙鳅亚科(Botiinae)、平鳍鳅亚科(Homalopterinae)和腹吸鳅亚科(Balitorinae)的统称。鳅类种类繁多，世界上已报道的鳅类约有62属600种；中国约52属300种，我国是鳅类种类最多的国家之一，是我国鱼类区系中仅次于鲤科鱼类的第二大类群，具有重要经济和生态价值。准确地鉴定物种，是鱼类资源保护和改良以及开展水域生态学研究的基础，但鳅类大部分种属个体较小，一些种类的鳞片需在光学放大镜下才能观察，体色斑纹多变(虫蚀状、圆斑、横斑、不规则斑等)，受不同环境地理差异和性别影响，形态相似种性状难以有效区分，使得传统的形态分类存在极大困难。同时，也因为此类鱼的生长环境多在山涧溪流和湖泊而难以获得，使得一些种类的分类地位长期难以明晰。随着分子生物学技术的发展，利用一段短的、标准的DNA序列对物种进行分类的DNA条形码技术己成为动物物种鉴定的重要手段。本研究测定了采集于中国63个淡水水系的20个省市、90个地点、共549尾鳅类样本，另从Genbank下载了12属27种共74尾序列，总计有613个标准的DNA条形码序列，代表了鳅类5亚科19属50种，旨在丰富我国鳅类的DNA条形码数据库，发现可能的隐存种或亚种，澄清部分争议物种的分类地位，结果如下：　　1.在截取的DNA序列截取长度约652bp鳅类DNA序列中，A+T(53.94%)的比例大于C+G(46.06%)的比列，呈现明显的反G偏倚。基于Kimura2-parameter模型的邻接树上，鳅类分成59个分支，除了贵州爬岩鳅(Beaufortia kweichowensis)和条斑爬岩鳅(Beaufortia pingi)、大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)和部分泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)分支混杂外，其余物种均独立成支，鳅科的3大亚科均为明显的单系分支，但平鳍鳅科2亚科在属间分布上有交叉。基于遗传距离的ABGD分析分成51个组别，而形态分类结果来看有50个物种，表明形态与分子分类的物种划分数量相差不大。　　2.基于K2P模型的亚科间的平均遗传距离是20.74%，亚科内的平均遗传距离为15.08%；属间平均遗传距离为20.29%；属内的平均遗传距离为15.75%，属内种间平均遗传距离为19.17%，属内种内的平均遗传距离是1.03%，种间遗传距离是种内遗传的18.6倍，形成明显的遗传间隔。除了单一样本的物种外，种内遗传距离在0.11%~6.75%，在1%以内的种有33种，占到全部种类的69%。　　(1)大鳞副泥鳅种内平均遗传距离达2.21%，分支内遗传距离为2.51%，分支间遗传距离22.51%，表明可能存在隐藏种；　　(2)横纹南鳅(Schistura fasciolatus)出现了2个分支，种内的遗传距离在2.64%；2分支间遗传距离是7.30%，分支间遗传距离与分支内遗传距离不构成“10×”法则，分析可能是横纹南鳅有近期辐射进化的趋势，或者是杂交种的出现；　　(3)中华花鳅种内遗传距离为6.75%。原定形态鉴为中华花鳅的样本在NJ树中呈现4个分支，分支间的遗传距离在15.8%~20.2%，分支内的遗传距离在0.24%~1.39%之间，二者的倍数相差11.4~84.2倍。后经仔细形态检视后，鉴定为大斑花鳅(Cobitis macrostigma)、黑龙江花鳅(C. lutheri)和沙花鳅(C. arenae)；　　(4)原形态鉴定为黑龙江泥鳅(M. mohoity)分支间遗传距离达到了12.5%。其中来自黑龙江漠河未定种泥鳅属与黑龙江泥鳅的分支内遗传距离为0.31%和1.99%，未定种分支间遗传距离是分支内的40.3倍，经重新鉴定和Genbank核酸比对后，定为俄罗斯泥鳅；　　(5)薄鳅(Leptobotia pellegrini)种内的遗传距离为2.58%，分为3个分支，分支3间的遗传距离是分支1内遗传距离的9.4倍，分支1与分支2关系较近，二者与分支3的距离较远，分析原因可能是近期分化和姐妹亚种的出现。

目录

声明

第一章 前言

1.1 鳅类总介

1.1.1 沙鳅亚科

1.1.2 条鳅亚科

1.1.3花鳅亚科

1.2 平鳍鳅科

1.2.1 平鳍鳅亚科

1.2.2 腹吸鳅亚科

1.3 DNA条形码简述

1.3.1 DNA 条形码技术的检测原理

1.3.2 DNA条形码的发展历史

1.3.3 DNA 条形技术的优缺点

1.3.4 DNA条形码技术在水生物资源上的应用

1.4 研究目的

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验试剂和设备

2.2.1 实验所用试剂和厂家

2.2.2 实验所用仪器和厂家

2.3 试验方法

2.3.1 样本准备和DNA提取

2.3.2 目的片段扩增

2.3.3 目的基因测序

2.4 数据处理和分析

2.4.1 序列比对和序列信息

2.4.2 系统发育树的构建、遗传距离计算和ABGD分析

第三章 实验结果

3.1 COI序列特征表述

3.2 鳅类邻接树聚类分析

3.3 鳅类的遗传距离分析

3.3.1 鳅类各阶元的遗传距离

3.3.2 鳅类NJ树各分支的遗传距离

3.3.3 基于NJ树特定分支遗传距离

3.4 COI序列间隙

第四章 讨论

4.1 鳅类DNA条形码特性与COI基因的可行性

4.2 鳅类的DNA条形码研究

4.3 各阶元遗传距离分析和分类问题探讨

4.3.1 分类阶元的聚类

4.3.2 部分物种的分类问题探讨

第五章 结论与展望

附录

参考文献

研究生期间发表论文

致谢