慢性鼻-鼻窦炎内在型分析及基因表达差异的初步研究

摘要

慢性鼻-鼻窦炎(CRS)是一种由多种不同潜在病理生理机制形成的复杂疾病.目前的研究现状主要包括以1型炎症、2型炎症或是混合型炎症特征为主的CRS,以及根据是否鼻腔鼻窦嗜酸性粒细胞浸润分为嗜酸性粒细胞性CRS(eosinophilic chronic rhinosinusitis,ECRS)和非嗜酸性粒细胞性CRS(non-ECRS).目前对CRSsNP炎症有限的研究表明其以1型炎症特征为主,而大量的研究表明西方国家的CRSwNP在NPs中表现出2型炎症特征和嗜酸性粒细胞增多.然而,亚洲CRSwNP患者则主要表现为混合型炎症模式,其中嗜酸性粒细胞与中性粒细胞浸润的比例接近1：1.因此,根据鼻腔鼻窦组织是否存在嗜酸性粒细胞增多而进一步分为嗜酸性粒细胞性CRS(ECRS)和非嗜酸性粒细胞性CRS(non-ECRS)并不足以清晰地定义具有不同病理生理学和细胞因子模式的内在型.因此,更进一步的CRS分型势在必行.　　长期以来,人们对于T淋巴细胞的研究集中在T辅助细胞1型、2型(Th1、Th2)、调节性T细胞(Treg)以及细胞毒性T细胞(Tc)等亚群上.传统理论认为,Th1细胞介导细胞免疫,在抗胞内菌感染的过程中发挥关键性作用;而Th2细胞则介导体液免疫,与过敏性疾病以及寄生虫感染的过程密切相关.Th1/Th2失衡被认为是许多疾病产生和发展的重要因素.其中2型细胞因子在慢性鼻窦炎症形成过程中起着重要作用,如IL-5,然而近年来发现的另一种Th细胞——Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17A对Th1/Th2模型在许多疾病中的地位发起了挑战.目前,人们已经认识到Th17/IL-17A在神经系统、消化系统、心血管系统、呼吸系统的多种疾病中发挥重要作用.同时也有一些细胞因子如IL-13,IL-22对CRS的作用及发病机制尚未明确.这些情况提示,目前关于CRS分型分期和疗效判断的指标,可能并没有真正反映出这种疾病的发病机理和病理生理实质,而只是对其表象的分类.由于CRS的发病机理不明,加之缺乏能真正反映其疾病实质的检测标准,使CRS成为看似简单,实则难以把握的疾病,严重妨碍了对其临床诊治水平的提高.因此,寻找能更客观地检测CRS疾病状态的实验室指标,探索新的分型分期和疗效判断标准,就成为CRS研究领域的重要课题.　　目的：　　本研究以人鼻腔鼻窦组织为研究对象.对39个CRS患者分别用两种RNA提取法提取RNA;对这些RNA样品进行建库测序和转录组分析,从而找到与CRS相关的分子生物学证据、差异性基因及其所在的信号通路,同时根据差异性基因分析情况进一步验证目标分型方法的可行性;检测血浆和鼻腔灌洗液样品中IL-5、IL-13、IL-17和IL-22的浓度并进行统计学分析,以验证根据鼻分泌物涂片嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润情况进行分型的可行性.最后根据细胞因子表达水平进行内在型分型、差异性基因分析.　　方法：　　1、患者入院后经询问病史、专科检查、辅助检查进行诊断.　　(1)传统地将CRS分为慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)和慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉(CRSsNP)这两种表型.　　(2)入院即行鼻分泌物涂片,检测其嗜酸性粒细胞和中性粒细胞阳性情况并以此进行分型：　　A型：嗜酸性粒细胞性CRS(Eos阳性+~++++,Neu阴性-);　　B型：中性粒细胞性CRS(Eos阴性-,Neu阳性+~++++);　　C型：混合型CRS(Eos阳性+~++++,Neu阳性+~++++);　　D型：非中性粒细胞性和非嗜酸性粒细胞性CRS(Eos阴性-,Neu阴性-).　　备注：显微镜下细胞计数"-"：0-10个,"+"：11-20个,"++"：21-30个,"+++"≥31个,"++++"为满视野).　　(3)根据IL-5、IL-13、IL-17A、IL-22表达水平高低情况进行分型.　　2、经鼻内镜手术获得鼻腔鼻窦组织后加RNAlater液冻存;分别使用TRIZOL和PureLink RNA Mini Kit试剂盒提取鼻腔鼻窦组织的总RNA,并测定其纯度和含量;将RNA纯化后储存;逆转录cDNA;利用illumina hiseq Xten测序平台完成鼻腔鼻窦组织样品的转录组测序;样本质检合格后进行文库构建;文库质检;Cluster制备;数据质控;分析CRS不同内在型的差异性基因并讨论与CRS内在型的相关性.　　3、分离外周血的血浆并提取PBMC;用Human-IL-5、IL-13、IL-17A、IL-22ELISA检测血浆中IL-5、IL-13、IL-17和IL-22的浓度.　　4、收取鼻腔灌洗液,ELISA测定鼻腔灌洗液中IL-5、IL-13、IL-17A和IL-22的浓度.　　5、对血浆和鼻腔灌洗液IL-5、IL-13、IL-17A、IL-22的ELISA检测结果进行统计学分析.　　6、对符合建库测序质量要求的样品对应的血浆和鼻腔灌洗液进行差异性分析以验证细胞因子内在型的可行性.　　结果：　　1、血浆IL-5浓度与血浆IL-13、IL-17A、IL-22浓度均呈显著正相关性(P<0.05);血浆IL-13与血浆IL-17A浓度呈显著正相关性(P<0.05);鼻腔灌洗液IL-5与鼻腔灌洗液IL-22浓度呈显著正相关性(P<0.05).血浆IL-22浓度与血浆IL-13、IL-17A和鼻腔灌洗液IL-22浓度均无显著相关性(P>0.05);鼻腔灌洗液IL-5浓度与鼻腔灌洗液IL-13、IL-17A和血浆IL-5均无明显相关性(P>0.05);鼻腔灌洗液IL-13与鼻腔灌洗液IL-17A、IL-22和血浆IL-13均无明显相关性(P>0.05);鼻腔灌洗液IL-17A与血浆IL-17A和鼻腔灌洗液IL-22均无明显相关性(P>0.05);血浆IL-5与鼻腔灌洗液IL-5无明显相关性(P>0.05);血浆IL-22与鼻腔灌洗液IL-22无明显相关性(P>0.05).　　2、LIFE ambion PureLink RNA Mini Kit试剂盒法提取RNA可能更优于TRIZOL法.　　3、A型与B型之间的差异性基因有662个,A型与D型之间差异性基因有753个,B型与D型之间的差异性基因数有736个,C型与D型之间的差异性基因有1025个,较A型和B型均有明显增多.　　4、A型vs D型、B型vs D型和C型vs D型这三种对比组合的共同差异性基因有122个,而这122个差异性基因表达水平的差异可能是形成不同的CRS亚型的原因所在,需要进一步对这122个差异性基因进行深入的研究分析.　　5、A、B、C、D四种亚型的共同差异性基因通路包括：金黄色葡萄球菌感染、核糖体、细胞色素P450对外源性物质的代谢、趋化因子信号通路、吞噬体、细胞因子与细胞因子受体相互作用通路,这些信号通路中作为目前研究较多的信号通路有4条：金黄色葡萄球菌感染、趋化因子信号通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用信号通路和哮喘通路.金黄色葡萄球菌感染通路中上调的差异性基因有C1S、CD64(FcyR)、C1QA(C1Q)、FPRL1(FPRL-1)、FPR、C5AR、CD18(ITGB2)、CD162(PSGL-1)、HLA-DMA(MHCⅡ),下调的差异性基因有C1R、ICAM1、HLA-DMA(MHCⅡ);趋化因子信号通路中上调的差异性基因有CCL26、CD186、CSF3、CSF3R、Vav、p47phox,下调的差异性基因有CSF3、CCL26;细胞因子与细胞因子受体相互作用通路中上调的差异性基因有CXCL1、CXCL6、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCR6、CXCR7、IL-2RA、IL8RA、IL8RB、IL-11、CCR1、CCR7、CCL7、CCL11、CCL13、CCL18、CCL20、CSF1R、CSF3R、CD254(TNFSF11)、INHBA、CD120B(SF1B),下调的差异性基因有CXCL14、CCL2、CCL5、CCL3L3(CCL3)、CCL4L(CCL4)、CCL13、CCL19、CCL21、IL-6、IL-9、IL-20、EGF、CSF3、CD295(LEPR)、CD264(SF10D).哮喘通路中上调的差异性基因有：HLA-DMA(MHC-Ⅱ)、FcERI(FcεRI)、CCL11(Eotaxin),下调的差异性基因有：IL-13、IL-10、FcERI(FcεRI)、HLA-DMA(MHC-Ⅱ)、IL-9.　　结论：　　1、血浆中IL-5、IL-13、IL-17A、IL-22在CRS的系统性炎症机制中发挥作用.　　2、鼻腔灌洗液IL-5与IL-22在CRS的局部炎症机制中发挥作用.　　3、PureLink RNA Mini Kit试剂盒法提取RNA可能明显优于传统的TRIZOL法.　　4、CRS相关的4个通路的主要的差异性基因有12个：C4、C5aR、FPR、CCL5、CCL19、CCL18、IL-8R、CCL26、MHCII、FcERI(FcεRI)、CCL11(Eotaxin)、CSF3.　　5、根据鼻分泌物涂片进行细胞分型具有一定的可行性和内在依据.

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ABSTRACT

第一章 前言

1.1慢性鼻-鼻窦炎概述

1.2 CRS的国内外研究状况

1.3一代测序、二代测序

1.4基因表达谱研究

1.5转录组学研究现状

1.6本课题研究目的及意义

1.7本课题研究内容

1.8本课题的来源

第二章 材料与方法

2.1研究对象

2.2鼻科临床资料

2.3 实验仪器、材料与试剂

2.4鼻腔鼻窦组织的总RNA提取

2.5 RNA定量及其浓度与完整性的检测

2.6链特异性文库构建

2.7文库质检及上机测序

2.8 测序数据处理

3．ELISA检测血浆、鼻腔灌洗液中IL-5、IL-13、IL-17A、IL-22

第三章 结果

4.1研究对象的基本特征

4.3文库构建及测序结果

4.4基因相关性分析

4.5差异性基因分析

4.6本课题实验结果汇总：

第四章 讨论

第五章 结论

展望与不足

参考文献

附录一

附录二

发表论文和参加科研情况说明

致 谢