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来源于人的硫脂酶超家族成员2以及晶状体蛋白Mu crystallin的晶体结构以及生物学功能研究

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缩略词

摘要

ABSTRACT

第一篇:来源于人的硫脂酶超家族成员2的生物学功能及晶体结构研究

第一章 研究背景综述

第一节 (§1-1) ‘热狗’折叠蛋白

第二节 (§1-2) 细菌中的苯乙酸降解途径

第三节 (§1-3) PAAI的功能

第四节 (§1-4) 来源于人的硫酯酶超家族成员2的简介

第二章 生物学功能研究

概述

第一节 (§2-1) THEM2在小鼠中的组织表达特异性

第二节 (§2-2) HTHEM2在真核细胞中的定位

第三节 (§2-3) 基于载体的SIRNA敲减以及细胞克隆形成实验

第四节 (§2-4) HTHEM2底物的筛选

第三章 HTHEM2的克隆,表达以及蛋白纯化

第一节 (§3-1) HTHEM2的克隆

第二节 (§3-2) HTHEM2的表达和纯化

第三节 (§3-3) SE-HTHEM2蛋白的制备

第四节 (§3-4) 突变体DBSA的构建及蛋白表达

第四章 HTHEM2晶体结构测定

第一节 (§4-1) 晶体生长

第二节 (§4-2) 数据的收集与处理

第三节 (§4-3) 衍射相位的求解

第四节 (§4-4) 结构修正

第五节 (§4-5) 最终模型的质量分析

第五章 HTHEM2晶体结构分析

第一节 (§5-1) 结构的描述

第二节 (§5-2) 与其他的‘热狗’折叠模式的结构比较

第三节 (§5-3) 酶反应催化机制

参考文献

第二篇 来源于人的晶状体蛋白MU CRYSTALLIN的结构与功能研究

第一章 研究背景综述

第一节 (§1-1) 简介

第二节 (§1-2) Mu-CRYSTALLIN的功能研究

第三节 (§1-3) 鸟氨酸环化脱氨酶/MU-CRYSTALLIN蛋白家族

第四节 (§1-4) OCD和ALADH的结构描述

第二章 晶体结构的测定

第一节.(§2-1) 结晶

第二节 (§2-2) 衍射数据的收集

第三节 (§2-3) 分子置换法求解相位

第四节 (§2-4) 在CNS中进行修正

第五节 (§2-5) 模型质量评估

第三章 晶体结构分析

第一节 (§3-1) MU CRYSTALLIN晶体结构描述

第二节 (§3-2) NADPH结合模式

第三节 (§3-3) PR090的TRANS/CIS异构化

第四节 (§3-4) 与鸟氨酸环化脱氨酶以及丙氨酸脱氢酶的结构比较

第五节 (§3-5) T3的可能结合位点

参考文献

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致谢

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摘要

人源硫酯酶超家族成员2(hTHEM2)在我们研究之前只是一个假想蛋白,对于其功能和结构一无所知。我们在结构基因组的项目支持下,首次克隆了该基因,并且在大肠杆菌中过量的表达,纯化,结晶该蛋白,并且利用Se-SAD法成功的解析了该蛋白2.3埃的晶体结构。晶体结构解析出之后,我们根据其结构与国外合作进行了其酶底物的筛选。为了了解其细胞内的功能,我们制备了该蛋白的单克隆抗体,同时也利用RT-PCR的方法检查了该蛋白在小鼠12种组织中的组织表达特异性,利用绿色荧光融合蛋白和免疫荧光的方法在两种癌细胞系中进行了其细胞内的定位,利用基于载体的siRNA敲减技术在HCT116细胞系中成功的对该基因进行了敲减。 人源硫酯酶超家族成员2的晶体结构显示该蛋白属于‘热狗’折叠模式,即六个β折叠片包裹着一个长的α螺旋。通过DALI搜索,我们发现该蛋白结构和来源于大肠杆菌的苯乙酸降解途径中的PaaI的结构非常相似,底物筛选的结果显示出与大肠杆菌PAAI具有相同的底物特异性:都可以水解苯环氧化的苯乙酸辅酶A生成苯环氧化的苯乙酸以及辅酶A,但是其催化效率却只有大肠杆菌的百分之一。位于中心α螺旋的上的残基Asp65,通过单点突变实验证明该位点是催化反应所必须的。
  通过RT-PCR在小鼠中的组织表达特异性表明,该蛋白在肾脏中有大量的表达,同时在大肠,小肠,脑,前列腺,子宫,睾丸中都有表达,而在胃中没有检测到有表达。关于细胞内的定位,利用两种独立的方法,即绿色荧光融合蛋白以及免疫荧光的方法都检测到该蛋白可能结合在微管上面。当细胞进入分裂期后,该蛋白的分布明显呈现出纺锤体的分布模式,利用免疫荧光的方法与β-tubulin的共定位实验证明该蛋白和微管蛋白是共定位的。通过siRNA敲减的细胞克隆形成实验证明,hTHEM2的敲减可以抑制癌细胞HCT116的生长。
  来源于人的P38细胞质T3结合蛋白,也叫做Mu_crystallin,在把甲状腺素T3从细胞质转运到细胞核以及在调控甲状腺荷尔蒙相关基因的表达方面起到非常重要的作用。我们利用悬滴法获得了该蛋白的单晶,并且在室内X光源上收集到一套2.6埃的晶体数据。使用分子置换法成功解析了相位并最终修正到2.6埃。晶体结构显示该蛋白可以分为两个结构域:二体化结构域以及NADPH结合结构域。分析发现不对称单位中的两个分子中的Pro90具有顺反异构的现象。通过与同源蛋白的结构比较我们提出了Mu crystallin与T3的结合模型。

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