小鼠肝脏免疫系统对自身免疫性肝损伤的调节机制

摘要

小鼠肝脏免疫系统对自身免疫性肝损伤的调节机制生命科学学院博士研究生王静导师田志刚教授肝脏作为机体免疫系统的重要组成部分，实时抵御外源抗原的攻击。同时，肝脏的免疫系统还具备精细的调节功能，以使在肝脏内发生的免疫耐受和免疫应答达到最适的动态平衡。肝脏免疫系统的组成不同于其他组织，它包含了众多的固有天然免疫细胞，如巨噬细胞、NK细胞和NKT细胞。这些细胞群体大量聚集在肝脏中，表明它们在肝脏生物学中具有重要的地位，能够为机体提供抵抗外来抗原入侵的免疫监视及保护作用。当这些免疫细胞功能表现异常时，将破坏肝脏内原有的免疫平衡，从而诱发一系列的肝脏病理损伤。然而，现阶段关于这些细胞之间的相互作用关系，及其在肝脏疾病过程中的作用机制尚不清楚。有鉴于此，本课题将着重探讨肝脏NK细胞和NKT/T细胞之间的作用关系对小鼠自身免疫性肝损伤的调节机制。 为实现以上研究目的，我们选用了ConA和polyI：C两种免疫激活剂。实验中运用不同的联合注射方式处理小鼠，以分别激活体内NKT/T细胞和NK细胞，并观察了在肝脏损伤过程中细胞间的相互调节关系。ConA(concanavalinA)是一种T细胞多克隆刺激剂，通常被用来建立小鼠肝脏损伤模型。高剂量ConA注射可诱导爆发性肝炎，这类肝损伤由活化的T细胞介导，NKT细胞以及一些炎症细胞因子例如TNF-α和IFN-γ也在此过程中行使重要的效应功能。另一方面，低剂量ConA处理能够诱导肝脏纤维化的发生和增强肝脏的抗肿瘤免疫应答，表明ConA可以作为一类T细胞的调节剂来对肝脏免疫应答行使调节功能。另一刺激剂polyI：C(polyinosinic-polycytidylicacid)因其自身结构与双链病毒RNA类似，所以它所引发的一系列免疫反应与病毒感染有某些相似之处。PolyI：C可以高度活化NK细胞并增强NK细胞的天然免疫功能，同时还能够募集大量的NK细胞迁移至肝脏内，表明polyI：C是肝脏NK细胞的一类强有力的激活剂，它能够通过激活TLR3(tolllikereceptor3)分子相关的信号通路来引发下游的免疫应答。由此可见，实验中选用ConA和polyI：C处理小鼠，可以分别活化肝脏NKT/T细胞和NK细胞，以实现我们对这些细胞间相互调节作用的研究。 实验过程中，我们采用赖氏法检测血清转氨酶水平、定量ELISA法检测血清细胞因子水平，以及组织染色方法观察肝脏病理学变化，并利用以上指标综合评估肝脏损伤；通过细胞过继转输和抗体清除实验，研究特定淋巴细胞群在肝脏损伤过程中的作用以及细胞间相互作用关系；采用流式细胞术精确测定各淋巴细胞亚群的表型，并对其活化状态和细胞因子分泌功能进行分析。此外，运用transwell细胞培养体系、特异抗体阻断实验以及特定基因缺陷小鼠，探讨了细胞间可能存在的相互作用方式。通过上述研究方案获得了如下结果： 1.TLR3配体促进了脾脏NK细胞向肝脏聚集实验采用TLR3的配体polyI：C，注射小鼠，观察了体内NK细胞在肝脏、脾脏、骨髓、胸腺和肺脏中的分布变化。实验结果显示正常小鼠肝脏NK细胞比例为8.55±1.05％，而在polyI：C注射后这一比例增加至38.96±2.03％，同时肝脏NK细胞的绝对数量也有显著增加。此外，polyI：C注射降低了NK细胞在脾脏中的聚集，而在其他器官中此类细胞在注射前后并没有发生明显的变化。通过脾脏转输实验，我们发现与其他被转输的淋巴细胞相比，NK细胞在肝脏聚集的比例最高，而切除小鼠脾脏可以明显降低polyI：C注射后肝脏NK细胞的数目。同时，T细胞的缺失也能够抑制NK细胞向肝脏的回流及其在肝脏中的活化。此外，RT-PCR结果显示NK细胞的迁移过程还伴随着肝脏中趋化因子FRK(fractalkine)和粘附分子VCAM-1(vascularcelladhesionmolecule-1)表达量的上升。以上实验结果表明polyI：C刺激能够使从脾脏迁移出来的NK细胞较特异性地迁移至肝脏，从而显著增加了肝脏NK细胞的比例和数目。同时，NK细胞向肝脏迁移的过程还受到趋化因子、粘附分子和T细胞的多重调控。 2.预活化的NK细胞负向调节肝脏T细胞并抑制T细胞介导的肝炎低剂量的polyI：C预处理能够减轻高剂量ConA注射所诱发的小鼠肝损伤。在ConA注射后24小时，血清转氨酶ALT水平达到7137±1069IU/L，而经polyI：C预注射后ALT水平降低至346±62IU/L。此外，polyI：C预注射还可以减轻肝脏病理损伤和延长致死剂量ConA注射后小鼠的生存时间。同时，polyI：C预注射也显著性地降低了血清中细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-4水平，以及肝脏NK细胞、NKT细胞和T细胞分泌细胞因子的功能。通过细胞清除和细胞转输实验，我们发现当清除了体内NK细胞后，polyI：C预注射对ConA引起的肝炎没有明显的作用，而转输活化的NK细胞又能有效地抑制肝脏损伤的发生，表明po1yI：C预注射对ConA诱导的肝损伤的抑制作用依赖于活化的NK细胞。此外，低剂量polyI：C注射能明显降低肝脏内NKT细胞和T细胞的数目，相反地却大大增加了NK细胞在肝脏的聚集程度：与正常组相比，肝脏内NK细胞数目增加了近5倍。同时，实验结果显示polyI：C注射增加了肝脏NKT细胞和T细胞表面凋亡分子AnnexinV和Fas的表达，并提高了杀伤分子FasL(Fasligand)在NK细胞上的表达量。而在经过polyI：C体外刺激的细胞培养体系中，抗体阻断FasL可以降低NKT细胞和T细胞中AnnexinV+细胞的比例。另外，经polyI：C注射的Fas-/-和FasL-/-缺陷小鼠的肝脏NKT细胞数目明显多于野生型对照组。以上实验结果表明polyI：C活化的NK细胞能通过Fas/FasL的相互作用负向调节NKT细胞和T细胞，进而发挥其抗肝脏损伤的作用。 3.预活化的T细胞正向调节NK细胞并加重NK细胞介导的肝脏损伤我们之前的研究已经发现小鼠经高剂量polyI：C注射后可以引起NK细胞的高度活化，并且特异性地向肝脏聚集。同时，机体表现出血清转氨酶水平的增加，以及肝脏中相应的轻微炎症浸润和病理损伤。通过细胞清除实验也已证明这种轻微的肝损伤是依赖于NK细胞的。在本实验中我们发现低剂量ConA预注射小鼠能够明显加重polyI：C引起的肝脏损伤。在polyI：C注射后24小时，血清转氨酶水平从170±22IU/L增加至1460±215IU/L，同时血清中IFN-γ水平也大幅度增加，肝脏内出现大面积的坏死区域。此外，ConA预注射还大大增加了polyI：C注射后肝脏NK细胞的数目，同时也增强了NK细胞分泌细胞因子的能力和细胞杀伤功能。当清除了小鼠体内T细胞后，ConA预注射对肝脏损伤的加重作用被明显削弱，而转输ConA预先活化的T细胞又可以加重polyI：C诱导的肝损伤。 低剂量ConA注射能够快速活化肝脏中的T细胞和NK细胞，但在活化时相上T细胞早于NK细胞，而NK细胞维持高度活化状态的时间明显长于T细胞。进一步的实验结果显示当T细胞缺失时，NK细胞的活化和细胞因子分泌能力都明显降低，而当培养体系中加入活化的T细胞，并与NK细胞进行混合细胞培养时，发现NK细胞的活化被明显加强；而当这两类细胞在transwell板内进行隔离培养时，NK细胞的活化受到明显抑制。以上实验结果表明ConA预活化的肝脏T细胞可能通过细胞接触的方式正向调节NK细胞功能，从而加重肝脏损伤。 综上实验结果表明：(1)polyI：C能够快速激活NK细胞，并在趋化因子、粘附分子和T细胞的协助下，促使NK细胞特异性地向肝脏迁移；(2)经polyI：C活化的NK细胞能够通过Fas/FasL作用诱导细胞凋亡，从而负向调节肝脏NKT细胞和T细胞，进而抑制了ConA诱导的T细胞所介导的肝损伤；(3)经ConA活化的T细胞能够正向调节NK细胞的免疫功能：不仅促进了NK细胞的活化，还增强了NK细胞的细胞因子分泌和细胞杀伤能力，进而加重了polyI：C诱导的NK细胞所介导的肝损伤。由此可见，肝脏免疫系统通过免疫细胞问的相互作用，对肝脏损伤进行精细调控。此项研究将有利于从细胞及分子水平上研究自身免疫性肝损伤的致病机制，从而更好地为临床治疗和药物开发提供理论依据。

目录

第一部分综述肝脏免疫细胞与肝脏免疫功能的关系

第二部分小鼠肝脏免疫系统对自身免疫性肝损伤的调节机制

致谢

附录

攻读学位期间发表的学术论文

攻读学位期间参加的学术会议

攻读学位期间获得的奖励