甘草次酸修饰和pH敏感的姜黄素混合胶束构建与抗肝癌细胞研究

摘要

目的：　　原发性肝癌是一种严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤。目前的治疗策略包括手术治疗、化学药物治疗、放射治疗、介入治疗。其中化学药物治疗对早中晚期肝癌均有一定的疗效，而且经常与其他治疗方法配合使用，是一种治疗肝癌的常用策略。然而化学药物原药由于存在非特异性药物递送、毒副作用等问题，临床使用效果不理想。因此，寻找一种安全有效的肝癌治疗药物是亟需解决的关键问题。根据古文献研究和现代药理研究结果，活血化瘀药姜黄中的姜黄素被认为是一种安全有效的广谱抗肿瘤药物，在体内外实验中姜黄素均表现良好的抗肿瘤药效，姜黄素抑制肿瘤细胞的药理作用包括抑制增殖、诱导凋亡、抑制转移和侵袭、逆转多药耐药性。此外，姜黄素具有保护肝细胞的作用，可以显著降低小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平，减轻小鼠急性肝细胞坏死的程度。然而姜黄素的临床应用受到其自身理化性质的限制，例如，水溶性差、生物利用度低、光稳定性差等。这些问题随着纳米技术的发展，得到了一定程度的改善，姜黄素载药胶束在提高抗肿瘤药效、利用EPR效应被动靶向至肿瘤组织等方面表现出一定的优势。但早期研制的胶束大多不具有功能性，所以在主动靶向、智能释放药物、载药量方面存在一些不足。　　因此，通过姜黄素亲水亲油平衡值测定、聚合物材料的化学合成与结构确认、聚合物材料热力学性质研究、混合胶束的制备、制剂学评价、体外药效评价，构建和评价一种基于Plurollic F68的甘草次酸主动靶向和pH敏感的混合胶束，以期降低F68的临界胶束浓度，提高其载药量和稳定性，并实现姜黄素的肝癌细胞主动靶向递送和细胞内弱酸性环境响应快速药物释放，从而进一步降低姜黄素对正常肝细胞的毒性，增强其抗肿瘤药效。并且尝试使用热力学第二定律解释疏水基团比重和制剂温度对胶束形成过程的影响。　　方法：　　1.通过酯化反应和亲电加成反应合成FAP、FBP、FAC、FBC、FGA，然后通过核磁共振氢谱(1H-NMR)和傅里叶红外光谱(FTIR)验证其化学结构，判断合成是否成功。　　2.首先，按照2015版《中国药典》第四部9101项下验证姜黄素含量检测方法的可行性。其次，使用该方法测量姜黄素在水中和正辛醇中的饱和浓度，并计算其比值的对数值logP，得到姜黄素的油水分配系数。然后，检测一系列已知亲水亲油平衡(HLB)值的表面活性剂的1H-NMR图谱，并对其进行处理分析，得到这些表面活性剂的HLB值与亲水基团系数(R)的线性函数，然后将F68及其衍生物的R值代入线性函数，计算F68及其衍生物的HLB值。最后，采用HPLC检测不同材料制备的姜黄素载药胶束的包封率和载药量，分析HLB值对包封率和载药量的影响。　　3.通过单因素实验，考察最佳的混合胶束(MIX)制备工艺条件，利用动态光散射仪(DLS)检测胶束的粒径、电位、多分布系数;利用HPLC检测胶束的包封率和载药量，分析比较得出最佳工艺条件。　　4.采用等温滴定量热法(ITC)测定不同材料形成胶束过程中的热量变化，比较胶束形成过程中熵、焓、吉布斯自由能的变化值，判断材料形成胶束的难易程度，解释聚己内酯(PCL)和胆固醇(CLR)修饰对F68热力学函数和CMC值的影响。与此同时，比较不同温度下胶束化熵、焓、吉布斯自由能的大小，判断温度对胶束形成的影响。并分析△G=△H-T·△S公式中涉及的三个变量熵变、焓变和温度对胶束形成的影响程度。　　5.通过一系列实验评价混合胶束的性状。利用动态光散射(DLS)考察胶束的粒径、电位、pH敏感性、稳定性;采用透射电子显微镜(TEM)观察胶束的外观形态;透析法考察累积药物释放情况;酶标仪检测胶束溶液的溶血性;使用芘荧光探针法测定聚合物的临界胶束浓度;利用丁达尔现象评价胶束的抗稀释能力。　　6.采用体外药效实验，在细胞水平评价姜黄素载药胶束的抗肿瘤药效。利用MTT实验考察姜黄素原药、FAP/姜黄素胶束、FBP/姜黄素胶束、MIX/姜黄素胶束对肝癌细胞和正常肝细胞的细胞毒性;采用流式细胞仪比较姜黄素原药与FAP、FBP、MIX胶束对肝癌细胞的促凋亡情况;使用高内涵细胞成像系统观察载药胶束对细胞核形态的影响及肝癌细胞对不同胶束的摄取情况;利用荧光分光光度法检测不同胶束对肝癌细胞内ROS水平。　　结果：　　1.经过1H-NMR和FTIR确认FAP、FBP、FAC、FBC和FGA合成成功　　2.姜黄素含量检测方法的方法学实验结果良好，能够准确检测制剂内的姜黄素含量;姜黄素的logP=3.77，属于亲脂性药物。不同表面活性剂的HLB值与R的线性函数为HLB=18.947*R+2.210，r=0.9987线性关系良好。数据结果表明F68及其衍生物的HLB值随着疏水链段分子量增加而减小。实验结果显示在同一种制剂条件下，包封率和载药量的变化与所使用材料的HLB值密切相关。在实验所涉及的六种材料范围内，随着HLB值减小，胶束的包封率和载药量逐渐提高，其中FAP和FBP胶束的包封率和载药量最高。　　3.单因素实验筛选得到制备FAP/姜黄素胶束的最佳工艺条件为：FAP10mg、姜黄素1mg，装入250m1茄形瓶中，加入丙酮5m1超声使溶解。60℃、-0.1Mpa，100rpm旋蒸除去丙酮，加入60℃的PBS10ml(pH=7.4)，60℃、常压、100rpm旋转水化30min，水化结束后，胶束溶液冷却至室温加纯水定容至10m1，过0.22μm滤膜，4℃保存待测。经过实验验证，该条件能够适用于FBP/姜黄素胶束溶液的制备，且重现性良好。MI刈姜黄素胶束的最佳FAP/FGA比例为1：1，其他参数与FAP/姜黄素胶束的工艺条件相同，且重现性良好。　　4.ITC结果显示，随着疏水性链段分子量增加，聚合物材料形成胶束的焓变、熵变增加、吉布斯自由能变化值减少，根据热力学第二定律，疏水性链段分子量增加能够使材料更容易自组装形成胶束，并且可能具有更好的热力学稳定性。同时，不同温度下MIX胶束的ITC结果显示，随着温度升高，胶束化吉布斯自由能的负值更大，说明FAP和FGA的混合物在较高的温度下更容易自组装形成胶束。在实验温度范围内，焓变的皆为正值，这种现象证明，FAP和FGA的混合物在水中形成胶束是吸热过程。当温度低于30℃，MIX胶束的熵变和焓变一起增加，高于30℃后熵变和焓变一起减少，对吉布斯自由能公式中涉及三个变量焓变、熵变和温度，分别求偏导数，吉布斯自由能的负值变化大小主要受到熵变和温度的影响，而焓变对吉布斯自由能的负值变化没有积极意义。因此熵的增加在驱动MIX胶束化中起着重要作用。　　5.通过薄膜水化法制备MIX胶束溶液，采用DLS测得粒径为91.06±1.37nm，电位为-9.79±0.47mV，经过修饰的FAP和FGA制备的MIX胶束的CMC约为1.702mg/L，远小于F68的CMC;HPLC测定载药胶束的包封率和载药量分别为75.13±1.36％和6.31±0.09％;MIX胶束在储藏条件下放置15天，在含10％FBS的PBS中放置24h，胶束的粒径均没有发生显著改变，说明MIX胶束的稳定性良好;此外，MIX胶束表现出显著的pH敏感性，在pH=5.0的介质中孵育6h后，胶束的粒径分布图由狭窄的单峰变成展宽的双峰、多重峰，说明胶束发生破裂、聚集，引起粒径变化;体外累积药物释放实验表明，与pH=7.4的释放介质相比，相同时间内pH=5.0的释放介质能使更多的药物被释放出来;溶血实验结果表明组成混合胶束的聚合物材料没有显著的溶血性，生物安全性良好。　　6.MTT实验表明与R心/姜黄素胶束、FBP/姜黄素胶束及姜黄素原药相比，MIX/姜黄素胶束对肝癌细胞有更强的细胞毒性，但是对正常肝细胞的毒性小于姜黄素原药。同时，在相同条件下，空白胶束对肝癌细胞和正常肝细胞没有显著的细胞毒性作用;流式细胞仪检测结果显示，给药24h后，姜黄素原药、FAP/姜黄素胶束、FBP/姜黄素胶束对肝癌细胞的促凋亡作用存在显著性差异，凋亡率由低到高依次为：姜黄素原药＜FBP/姜黄素胶束＜RAP/姜黄素胶束＜MIX/姜黄素胶束，说明pH敏感和GA介导的主动靶向能够提高姜黄素的抗肿瘤效果;通过比较姜黄素载药胶束和姜黄素原药的高内涵细胞成像仪实验结果可知，在肝癌细胞中，姜黄素载药胶束组的细胞核变形、皱缩数量较多，说明胶束能够提高姜黄素的促凋亡作用;在ROS水平测试中，细胞内的荧光强度顺序为：姜黄素原药＜FBP/姜黄素胶束＜FAP/姜黄素胶束＜MIX/姜黄素胶束;流式细胞仪的细胞摄取实验结果表明，NR载药胶束组的肝癌细胞内荧光强度较NR原药组高，载药胶束各组细胞内荧光强度比较MIX/，NR胶束＞Ⅳo/NR胶束≈FBP/NR胶束。高内涵细胞成像仪观察的实验结果也显示具有主动靶向功能的MIX，NR胶束细胞内红色荧光强度最高。　　结论：　　通过聚合物材料化学结构确认、胶束制剂评价与表征，制剂体外药效学评价，成功构建了基于F68的甘草次酸主动靶向和pH敏感的MIX胶束，该制剂能够提高姜黄素的水溶性、特异性的将姜黄素递送至肝癌细胞内，并响应细胞内的弱酸性环境快速释放药物，增强姜黄素的抗肝癌药效，同时降低对正常肝细胞的毒副作用，为姜黄素纳米胶束的研制和应用提供实验依据和支持。此外，围绕F68及其同系物的HLB值、CMC、焓变、熵变、吉布斯自由能等热力学性质和函数的研究，初步解释了熵增加在驱动MIX胶束化中起着重要作用。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

创新点

论文综述

1肝癌的流行病学概况及现有治疗策略

2活血化瘀药治疗肝癌的理念和姜黄素的抗肿瘤药理作用

2．1抑制增殖

2．2诱导凋亡

2．3抑制侵袭和转移

2．4逆转多药耐药性

3姜黄素临床应用面临的问题

3．1口服生物利用度低

3．2体内代谢迅速

3．3水溶性差

4抗肿瘤纳米制剂

4．1主动靶向胶束

4．2环境响应胶束

4．3多功能混合胶束

5设计思路

技术路线图

第一章基于F68的衍生物合成和结构确认

1引言

2仪器与试剂

2．1试剂

2．2仪器

3．1 FAP合成路径

3．2 FBP合成路径

3．3 FGA合成路径

3．4 FAC合成路径

3．5 FBC合成路径

3．6聚合物结构分析

4结果

4．1核磁共振氢谱

4．2傅里叶红外图谱

5讨论

第二章姜黄素油水分配系数测定和聚合物材料的HLB与包封率、载药量相关性研究

1引言

2仪器与试剂

2．1试剂

2．2仪器

3实验方法

3．1建立姜黄素含量测定方法

3．2姜黄素油水分配系数测定

3．3聚合物材料HLB计算

3．4聚合物HLB与包封率、载药量相关性研究

4实验结果

4．1姜黄素含量测定方法

4．2姜黄素油水分配系数计算

4．3聚合物HLB计算

4．4 HLB与包封率、载药量的相关性

5讨论

第三章FAP、FBP和MIX的姜黄素载药胶束制备工艺优化

1 引言

2仪器与试剂

2．1试剂

2．2仪器

3实验方法

3．1考察FAP／姜黄素胶束制备方法

3．2考察制备FAP／姜黄素胶束的最佳溶剂

3．3考察制备FAP／姜黄素胶束的最佳投药量

3．4考察制备FAP／姜黄素胶束的最佳温度

3．5考察制备FAP／姜黄素胶束的最佳水相体积

3．6 FAP／姜黄素胶束工艺条件验证

3．7考察最优工艺对FBP／姜黄素胶束制备的适用性

3．8考察制备MIX／姜黄素胶束的最佳材料比例

4．1制备FAP／姜黄素胶束的最佳制剂方法

4．2制备FAP／姜黄素胶束的最佳有机溶剂

4．3制备FAP／姜黄素胶束的最佳投药量

4．4制备FAP／姜黄素胶束的最佳温度

4．5制备FAP／姜黄素胶束的最佳水相体积

4．6最佳工艺条件验证

4．7考察最优工艺对FBP／姜黄素胶束制备的适用性

4．8考察制备MIX/姜黄素胶束的最佳材料比例

4．9 MIX／姜黄素胶束工艺条件验证

5讨论

第四章疏水链段修饰后CMC下降和温度对胶束制备影响的热力学研究

1引言

2仪器与试剂

2．1试剂

2．2仪器

3实验方法

3．1疏水链段分子量对材料热力学函数的影响

3．2温度对混合胶束的热力学性质的影响

4实验结果

4．1疏水链段分子量对材料热力学函数的影响

4．2温度对混合胶束热力学函数的影响

5讨论

第五章姜黄素载药胶束的制剂学评价

1引言

2仪器与试剂

2．1试剂

2．2仪器

3方法

3．1胶束外观形态评价

3．2稳定性

3．4 CMC和丁达尔现象

3．5体外累积释放

3．6材料的溶血性实验

4 结果

4．1 MIX／姜黄素胶束的外观形态

4．2胶束的稳定性

4．3胶束的pH敏感性

4．4丁达尔现象和CMC

4．5体外累积释放率

4．6溶血性实验

5讨论

第六章MIX/姜黄素胶束细胞水平体外药效学评价

1引言

2仪器与试剂

2．1试剂

2．2仪器

3方法

3．1细胞培养

3．2细胞活性实验

3．3细胞凋亡实验

3．4不同胶束对细胞核形态的影响

3．5不同胶束对细胞内ROS水平的影响

3．6尼罗红含量测定方法和载药胶束制备

3．7肝癌细胞对不同胶束的摄取能力考察

4结果

4．1细胞活性实验

4．2细胞凋亡实验

4．3不同胶束对细胞核形态的影响

4．4不同胶束对胞内ROS水平的影响

4．5尼罗红含量测定方法和载药胶束制备

4．6细胞摄取实验

5讨论

全文总结

1总结

2不足之处及展望

参考文献

致谢

个人简历