双参宁心胶囊调控FUNDC1介导的线粒体自噬保护心肌缺血再灌注损伤机制研究

摘要

尽管已有大量文献报道了很多对抗MI砌的药物，目前尚没有针对线粒体自噬防治MI砌的药物，尚无完全对抗MI对的办法，仍需深入探索MIⅪ的治疗靶点和药物。近年来众多研究发现中药可以通过调控线粒体自噬防治MI刚，期望通过中药调控线粒体自噬角度揭示SSNX治疗MI刚的作用机制，为SSNX更好应用于临床提供研究证据。　　第一部分 双参宁心胶囊保护大鼠心肌缺血再灌注损伤机制研究　　第一节 双参宁心胶囊对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究　　目的：　　探索SSNX对大鼠MI砌的保护作用。　　方法：　　以SD大鼠为研究对象，实验分为双参宁心大、中、小三个剂量(180、90、45mg·kg-1)组及正常组和模型组五组，按药物剂量(正常组、模型组给予等量生理盐水)灌胃给药7d后，结扎冠状动脉左前降至，构建MI砌模型，控制结扎时间为45min，再灌时间为3h。血流动力学检测大鼠动脉舒张压和动脉收缩压，左室舒张末压、左室峰压、左室内压最大下降速率、左室内压最大上升速率等指标，观察大鼠心功能相关指标变化;血清学检测大鼠血清CK、CK.MB和LDH含量;心肌组织TTC和Evan’s Blue双染色观察大鼠心肌缺血梗死面积变化;心肌组织HE染色观察大鼠心肌组织病理形态变化。　　结果：　　结果显示，模型组CK、LDH、CK-MB含量较正常组均升高;与模型组相比，SSNX各组对大鼠血清CK-MB含量均有降低作用，中剂量组大鼠血清中CK、LDH、小剂量组LDH含量降低。　　小结：　　大鼠MIRI模型稳定，SSNX对大鼠MIRI模型存在保护作用，90mg·kg-1、180mg·kg-1时保护作用显著优于45mg·kg-1。因此选择剂量90mg·kg-1进行后续作用机制研究。　　第二节 双参宁心胶囊调控FUNDC1介导的线粒体自噬保护大鼠缺血再灌注损伤作用机制研究　　目的：　　探索SSNX保护大鼠MIRI是否与调控FUNDCl介导的线粒体自噬有关。　　方法：　　以SD大鼠为研究对象，实验分为双参宁心组、正常组、模型组三组，灌胃给药(正常组、模型组给予等量生理盐水)7d后，结扎冠状动脉左前降至，构建MIRJ模型，控制结扎时间为45min，再灌时间为3h。宏观表征检测大鼠舌苔、脉象;血清学检测大鼠血清cTnT含量;小动物超声检测大鼠心功能各项指标;铁矾苏木素伊红染色法光镜下观察大鼠心肌组织形态学改变;Westem Blot检测LC3-I、LC3-Ⅱ、cleaved caspase-3、BNIP3、NIX、FUNDCl蛋白表达情况。　　结果：　　脉搏变化表现为正常组大鼠脉象平缓有力，幅度适中，节律匀齐;与正常组比较，模型组大鼠脉搏幅度显著降低，不够流利，往来艰涩，幅度变小，节奏变快;与模型组相比，双参宁心组大鼠脉搏幅度升高、脉象缓和。正常组舌质淡红，苔薄白，模型组大鼠舌质较正常组颜色偏暗红，苔暗白，舌面R、B值均降低;双参宁心组大鼠与模型组相比舌质暗红、苔暗自均有改善，舌面R、G、B值均有升高趋势，但差异没有统计学意义。　　小结：　　大鼠心肌缺血后再灌注阶段线粒体自噬水平升高，可能与FUNDCl介导的线粒体自噬的激活有关，BNIP3、NIx介导的线粒体自噬没有发现激活现象。SSNX对大鼠心肌缺血后再灌注阶段心肌细胞内线粒体自噬存在抑制作用，SSNX对大鼠MI刚的保护作用可能与该抑制作用相关。进一步研究发现该抑制作用可能与抑制FUNDCl介导的线粒体自噬激活有关，而对BNIP3、NIX介导的线粒体自噬未发现调控作用。　　第二部分 双参宁心胶囊有效成分Rg1、THP、Sal B保护H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的机制研究　　第一节 Rg1、THP、Sal B对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的最佳保护剂量研究　　目的：　　明确人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B的适宜剂量，进行后续保护作用及机制研究。　　方法：　　在对正常培养H9c2心肌细胞活性影响的实验中以H9c2心肌细胞研究对象，实验分为正常组、药物各剂量组，观察人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B对正常培养H9c2心肌细胞活性的影响。用完全DMEM培养基培养正常组;各药物组分别用含药物的完全DMEM培养基培养。细胞以1×105·mL-1密度接种于96孔细胞板36h后，待细胞融合达到70～80％，弃旧培养基，PBS洗孔2次之后，各组换相应培养基，37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中进行24h正常培养。药物作用24h后，采用CCK-8法检测细胞活性。　　结果：　　对正常培养H9c2心肌细胞活性影响实验结果显示，人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B分别在800μmol·L-1、180μmol·L-1、180μmol·L-1及以上浓度对正常培养心肌细胞活性有抑制作用。　　对H/R损伤H9c2心肌细胞活性影响研究结果显示，与正常组相比，模型组细胞活性显著下降:与模型组相比，人参皂苷R91三个剂量组均可显著升高细胞活性，浓度为100umol·L-1时，细胞存活率最高;延胡索乙素浓度为45μmol·L-1时可显著升高细胞活性;丹酚酸B三个剂量组均可显著升高细胞活性，45μmol·L-1时细胞存活率最高。　　小结：　　人参皂苷Rg1100μmol-L-1、延胡索乙素45μmol·L-1、丹酚酸B45μm01·L-1对H9C2心肌细胞H/R损伤保护作用较好。　　第二节 Rg1、THP、Sal B对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用　　目的：　　研究人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B对H9c2心肌细胞H/R损伤的保护作用。　　方法：　　以H9c2心肌细胞H/R损伤模型为研究对象，实验分为正常组、模型组、Rg1组、THP组、Sal B组。用完全DMEM培养基培养正常组;用无糖无氧DMEM培养基培养模型组，缺氧复氧均不加任何药物;各药物组缺氧同时加入受试药物，其余过程同模型组。细胞以1×105·mL-1密度接种于96孔、6孔细胞板或细胞共聚焦培养皿中36h后，待细胞融合达到70～80％，弃旧培养基，PBS洗孔两次之后，换相应培养基，将细胞放进充入氮气的缺氧盒中密闭培养4h;缺氧结束后，每孔加入49.59·L-1葡萄糖10μL，使葡萄糖终浓度为4.5g·L-1，37℃、5％CO2培养箱中进行2h复氧复糖培养。　　复氧复糖2h结束后，取细胞培养上清采用微量酶标法进行LDH含量检测;取培养的细胞采用化学荧光法测量细胞ROS水平，于活细胞工作站下观察荧光强度。　　结果：　　H9c2心肌细胞H/R损伤后，心肌细胞活性下降，LDH漏出量明显增加，细胞内ROS水平升高。Rg1、THP、Sal B对H/R损伤后H9c2心肌细胞LDH漏出量和ROS水平均有降低作用。　　小结：　　人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B对H9c2心肌细胞H/R损伤具有保护作用。　　第三节 Rg1、THP、Sal B调控FuNDcl介导的线粒体自噬保护H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤机制研究　　目的：　　探索人参皂苷Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B对H9c2心肌细胞H/R损伤的保护作用是否与调控FUNDCl介导的线粒体自噬有关。　　方法：　　模型建立及分组和给药方法同第二部分第二节。　　取复氧复糖2h后细胞，采用萤光素酶法检测细胞内ATP含量;取复氧复糖2h后的细胞，采用化学荧光法检测△ψm变化，并于活细胞工作站观察线粒体膜电位变化并拍照。Westem blot检测Cleaved caspase-3、LC3-I、LC3-Ⅱ、FUNDC1蛋白表达情况。　　结果：　　结果显示H/R损伤使H9c2心肌细胞ATP含量、△ψm显著降低;与模型组相比，Rg1组、THP组、Sal B组ATP含量、△ψm均显著升高。模型组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，线粒体途径凋亡蛋白C1eaved caspase-3、介导线粒体自噬的膜受体蛋白FUNDCl表达较正常组均显著增加;与模型组相比，Rg1组、THP组、Sal B组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、C1eaved caspase-3、 FUNDCl表达显著降低。　　小结：　　H/R损伤使H9c2心肌细胞线粒体自噬过度激活，诱导了线粒体途径凋亡的发生，该激活作用与FUNDCl介导的线粒体自噬有关。人参皂苷R91、延胡索乙素、丹酚酸B通过抑制FUNDCl介导的线粒体自噬，升高线粒体膜电位，改善细胞内能量代谢情况，发挥保护H/R损伤使H9c2心肌细胞的作用。　　结论：　　SSNX通过抑制FUNDCl介导的线粒体自噬保护大鼠MI刚，人参皂苷R91、延胡索乙素、丹酚酸B抑制FUNDCl介导的线粒体自噬保护H9c2心肌细胞H/R损伤。推测人参皂昔Rg1、延胡索乙素、丹酚酸B是SSNX调控FUNDCl介导的线粒体自噬保护MI对的物质基础。中药SSNX有望成为调控线粒体自噬对抗MI刚的有效治疗药物。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

综述 中药调控线粒体自噬防治疾病的研究进展

1．线粒体自噬概述

2．介导线粒体自噬的关键分子

2．2 FUNDC1介导的线粒体自噬

2．3 BNIP3、NIX介导的线粒体自噬

3．线粒体自噬与疾病

4．中药对线粒体自噬的调控作用

4．1中药调控线粒体自噬防治心脑缺血再灌注损伤

4．2中药调控线粒体自噬防治肿瘤

4．3中药调控线粒体自噬防治神经系统疾病

4．4中药调控线粒体自噬防治糖尿病及糖尿病相关疾病

4．5中药调控线粒体自噬防治肝肾疾病

4．6其它

5．小结

参考文献

前言

第一部分双参宁心胶囊保护大鼠缺血再灌注损伤机制研究

第一节双参宁心胶囊对大鼠缺血再灌注损伤保护作用研究

1．材料

2．方法

3．结果

4．小结

第二节双参宁心胶囊介导FUNDC1通路调控线粒体自噬保护大鼠缺血再灌注损伤机制研究

1．材料

2．方法

3．结果

4．小结

第二部分SSNX有效成分Rg1、THP、Sal B保护H9c2心肌细胞缺氧／复氧损伤的机制研究

1．实验材料

2．方法

3．结果

4．小结

第二节Rg1、THP、Sal B对H9c2心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用

1．实验材料

2．实验方法

3．结果

4．小结

第三节R91、THP、sal B调控FuNDcl介导的线粒体自噬保护H9c2心肌细胞缺氧／复氧损伤机制研究

1．实验材料

2．实验方法

3．结果

4．小结

讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历