转JERF36基因对银中杨内生菌多样性、DNA甲基化及基因表达影响研究

摘要

通过基因工程技术将外源基因转入到林木基因组弥补了其传统育种周期长、过程繁琐、性状难以人为控制的缺点。因此，获得了大量遗传性状改良或新性状的转基因(GM)林木新品系。林木转基因技术创新日益加速，在抗虫、抗病、抗除草剂、抗非生物胁迫、降低木质素含量等方面研究成果显著，极大地促进了林业生产与发展，展现出巨大的经济效益前景。然而，转基因植物的改良效果、安全性以及外源基因的作用机制备受国内外学者关注。目前，关于转基因植物对根际微生物和内生菌影响的研究主要集中在一年生作物和草本植物上，而对生长周期较长的林木研究较少。本研究以成龄期转基因银中杨（Populus alba×P.berolinensis）（外源基因为JERF36，编码AP2/EREBP植物转录因子，与植物抗逆性相关）及非转基因银中杨为试验材料，采用16S rRNA和内部转录间隔区(ITS)扩增子Illumina MiSeq测序技术对分别生长在盐碱（大庆）和非盐碱地区（齐齐哈尔）的转基因银中杨及其非转基因对照中内生细菌和真菌的多样性进行了评估;采用全基因组甲基化和转录组测序技术研究了外源基凶以及环境条件对杨树全基因组DNA甲基化模式和基因表达的影响。论文的主要研究结论如下:　　1.转基因事件并未影响杨树内生细菌和真菌群落的多样性。根内生细菌和真菌的群落结构取决于土壤有机质含量和pH值，而茎中的内生菌群落结构即使在不同的环境条件下也保持稳定。杨树的根和茎分别代表着微生物群落独特的生态位。　　2.测序结果根据97％的序列相似性水平，将细菌和真菌的reads分别归类为1.493和321个OTU。与数据库比对后确定银中杨内生细菌群落主要以放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门为主，内生真菌群落主要以座囊菌纲、伞菌纲、子囊菌纲、锤舍纲、散囊菌纲和银耳纲为主。确定了与不同杨树组织部位和不同环境条件相关的核心微生物，共获得37个核心细菌OTU，归属于6个门;36个核心真菌OTU，归属于11个纲。还确定了14个根内生细菌指示OTU，5个茎内生细菌指示OTU，9个根内生真菌指示OTU，2个茎内生真菌指示OTU。为寄主-微生物相互作用的进一步研究提供基础。　　3.转基因杨树具有提高生物和非生物耐受性的能力。转基因和非转基因银中杨之间差异表达的基因中有30-50％含有外源基因JERF36的调控元件。上调表达的基因与光合作用代谢途径和抗十旱肋迫相关。转基因杨树与非转基因杨树之间共获得25个差异农达基因，其中6个基因在两个地点同时上调，被注释到干旱胁迫的杨树叶片和应拉木中的EST以及光合作用光系统Ⅱ的两个关键蛋白PsbK和PsbI。大庆和齐齐哈尔两个地点杨树之间共获得426个差异表达基因，大庆地区上调表达的基因增强了杨树对真菌病原微生物的防御功能，而齐齐哈尔地区上调表达的基因增强了杨树对细菌病原微生物的防御功能。基因与环境互作效应引起的差异表达基因主要参与杨树抗干旱胁迫、光合作用等代谢途径。　　4.银中杨基因组主要甲基化形式表现为以CG甲基化为丰，甲基化水平为31.10％。各个功能元件区CG型DNA甲基化水平最高，且变化幅度较大。在启动子上游序列区域甲基化水平较低，而基因body区域甲基化水平较高。CHG和CHH型DNA甲基化水平较低，且较为稳定。基因组中CHG位点序列为CAG时最易被甲基化;基因组中CHH位点序列为CAA时最易被甲基化。CHH位点的DMRs最多，CG和CHG位点的DMRs数量相对较少，DMRs长度主要集中在10-100bp，且在染色体上均匀分布，不存在染色体偏好性。　　5.对差异甲基化区域(DMRs)进行注释，环境因素引起的差异甲基化基因(DMGs)数目大于转基因引起的差异甲基化基因数目。对差异甲基化基因进行功能富集分析发现主要富集于次级代谢产物合成、抗生素合成、RNA转运、不同环境中微生物代谢等代谢途径。　　6.通过甲基化与基因表达的相关性得出，基因甲基化水平与表达量有正相关也有负相关，但均未达到显著水平，不同生态环境下转基因与非转基因杨树基因表达受甲基化调控作用不显著。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1引言

1．2转基因林木的研究现状

1．2．1林木转基因技术简介

1．2．2林木转基因技术的优势

1．2．3林木转基因技术的生态安全风险

1．3转基因植物内生菌的研究现状

1．3．1植物内生菌简介

1．3．2植物内生菌促进宿主植物生长

1．3．3植物内生菌的影响因素

1．3．4转基因植物内生菌研究进展

1．4转基因植物转录组学的研究现状

1．5植物基因组DNA甲基化的研究现状

1．5．1植物基因组DNA甲基化调控基因表达的研究进展

1．5．2转基因植物基因组DNA甲基化的研究现状

1．6主要研究内容

1．7技术路线

第二章转JERF36基因银中杨内生菌多样性研究

2．1材料与方法

2．1．1试验林概况与取样方法

2．1．2试验方法

2．2结果与分析

2．2．1 Illumina测序的质量指标

2．2．2α多样性

2．2．3 β多样性

2．2．4微生物群落与环境因子的相关性

2．2．5内生菌的群落结构

2．2．6核心物种分析

2．2．7指示种分析

2．3小结

第三章转JERF36基因银中杨基因组DNA甲基化研究

3．1材料与方法

3．1．1试验材料

3．1．2试验方法

3．2结果与分析

3．2．1甲基化测序数据统计与覆盖度分析

3．2．2全基因组甲基化水平分析

3．2．3 CG、CHG、CHH位点甲基化水平及比例分析

3．2．4 CG、CHG、CHH附近碱基的序列特征分析

3．2．5差异甲基化区域(DMRs)分析

3．2．6 DMGs GO富集和KEGG Pathway分析

3．2．7外源基因导入对基因甲基化的影响

3．2．8环境条件对基因甲基化的影响

3．3小结

第四章转JERF36基因银中杨基因表达差异研究

4．1材料与方法

4．1．1植物材料

4．1．2 RNA提取

4．1．3 cDNA文库构建和转录组测序

4．1．4转录组数据分析

4．1．5实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析

4．2结果与分析

4．2．2转基因和非转基因杨树间的基因表达分析

4．2．3调控元件分析

4．2．4外源基因导入对基因表达的影响

4．2．5环境条件对基因表达的影响

4．2．6基因与环境互作对基因表达的影响

4．3小结

第五章DNA甲基化与基因表达的调控关系

5．1试验方法

5．1．1 DNA甲基化水平与基因表达水平相关性分析

5．1．2 DNA甲基化水平与表达水平相关基因的Go注释和KEGG通路分析

5．2实验结果

5．2．1 DNA甲基化水平与基因表达水平的相关性

5．2．2转基因与非转基因杨树间DNA甲基化水平与表达水平相关基因的功能分析

5．2．3不同环境下DNA甲基化水平与表达水平相关基因的功能分析

5．3小结

第六章讨论与结论

6．1．2环境因素对杨树内生菌群落的影响

6．1．3杨树根与茎内生菌群落的生态位差异

6．1．4转JERF36基因银中杨基因组DNA甲基化与基因表达的关系

6．2结论

6．3展望

参考文献

附录

在读期间的学术研究

致谢