巨桉ZFP家族基因克隆和表达分析及EgrZFP1的调控因子筛选

摘要

C2H2型锌指蛋白是最常见的转录因子之一，既能够参与调控植物的生长发育，也参与植物的抗逆境胁迫。植物中最早分离出的C2H2型锌指蛋白基因是矮牵牛的ZPT2-1，之后也陆续在拟南芥、棉花、大豆、水稻等植物中分离出了该类型的锌指蛋白基因。先前分离得到的C2H2型锌指蛋白基因主要是草本植物的，很少有木本植物。　　 本研究通过同源克隆的方法从低温诱导的巨桉幼苗中克隆到7个C2H2型锌指蛋白基因，分别命名为EgrZFP1-7。它们编码的蛋白都属于C1类C2H2型锌指蛋白，由于都具有QALGGH基序，他们也属于Q型C2H2型锌指结构。除了EgrZFP2以外，其它六个预测蛋白都具有EAR基序。　　 对EgrZFP1-7基因的表达分析表明，它们在根、茎、叶中都表达，除了EgrZFP4和EgrZFP6以外的其它5个基因在根、茎、叶中的表达量没有明显区别。EgrZFP4在根中表达量最高，而EgrZFP6在叶中表达量最低。不同逆境下，EgrZFP基因的表达分析表明:它们在低温下被诱导表达，2℃或4℃下的表达量最高。4℃不同时间处理下，EgrZFP1-6的表达量在48h时达到最高，然而EgrZFP7表现出了瞬时表达的特性。盐胁迫(NaCl，200 mM)下，EgrZFP1-6表达量增加，而EgrZFP7的表达受到抑制。EgrZFP1-7基因都不受ABA（100μM）诱导表达，说明它们可能不通过ABA逆境响应途径发挥作用。这说明，在巨桉中EgrZFP1-7基因经由ABA非依赖型途径参与冷胁迫和盐胁迫响应。　　 通过酵母单杂交实验筛选得到了EgrZFP1可能的转录因子:NAM保守结构域的NAC转录因子、β-半乳糖苷酶、ATP酶、水通道蛋白、光合作用相关蛋白和两个无功能注释蛋白。本研究对基因P3-1，4,5的表达分析，结果表明:表达NAC转录因子的P3-1基因在冷、盐胁迫下表达量增加，而干旱和ABA处理下表达量没有明显变化;P3-4,5的表达量在ABA、盐、冷胁迫下都没有明显变化，而在干旱下表达量增加。说明3个基因都是经由ABA非依赖型途径参与逆境胁迫响应。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献综述

1．1 植物抵御非生物胁迫的分子机制研究现状

1．1．1 低温胁迫及其转录级联反应

1．1．2 盐胁迫和离子信号

1．1．3 干旱胁迫和渗透信号

1．2 植物C2H2型锌指蛋白研究进展

1．2．1 C2H2型锌指蛋白的结构特点和功能区

1．2．2 C2H2型锌指蛋白的功能

1．3 顺式作用元件及转录因子的研究方法

1．3．1 生物信息学分析与预测

1．3．2 突变分析法

1．3．3 凝胶阻滞法

1．3．4 DNase Ⅰ足迹法

1．3．5 酵母单杂交体系

1．4 技术路线

第二章 巨桉C2H2型锌指蛋白基因ZFP家族的克隆

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器

2．1．4 桉树总RNA的提取

2．1．5 琼脂糖凝胶电泳检测RNA

2．1．6 反转录cDNA第一链的合成

2．1．7 目的基因全长cDNA的分离

2．2 结果与分析

2．2．1 EgrZFP基因的克隆

2．2．2 EgrZFP蛋白的序列分析

2．3 讨论

第三章 巨桉EgrZFP基因家族的表达分析

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 试剂

3．1．3 材料的处理

3．1．4 总RNA的提取

3．1．5 EgrZFP基因组织特异性表达分析

3．1．6 冷处理

3．1．7 ABA、干旱和盐处理

3．1．8 实时荧光定量RT-PCR

3．2 结果与分析

3．2．1 巨桉不同器官中EgrZFP1-7的表达分析

3．2．2 EgrZFP1-7在非生物胁迫下的表达分析

3．3 讨论

第四章 酵母单杂交cDNA文库构建

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 试剂

4．1．3 仪器

4．1．4 Total RNA的提取

4．1．5 mRNA的分离

4．1．6 cDNA文库的构建

4．1．7 酵母单杂交cDNA文库的构建

4．2 结果与分析

4．2．1 总RNA质量检测

4．2．2 mRNA的分离

4．2．3 初级cDNA文库质量检测

4．2．4 酵母单杂交文库质量检测

4．3 讨论

第五章 酵母单杂交系统筛选EgrZFP1的转录因子

5．1 材料与方法

5．1．1 实验试剂

5．1．2 启动子序列克隆及顺式作用元件分析

5．1．3 获得Bait-pAbAi质粒

5．1．4 获取Bait酵母菌株

5．1．5 Bait菌株的自激活检测

5．1．6 转酵母单杂交文库质粒到Bait菌株中

5．1．7 筛选出的克隆的阳性分析

5．1．8 筛选出的阳性克隆功能分析

5．2 结果与分析

5．2．1 EgrZFP1的启动子分析

5．2．2 Bait菌株构建分析

5．2．3 Bait菌株自激活检测分析

5．2．4 文库筛选结果分析

5．2．5 筛选出的基因的表达分析

5．3 讨论

第六章 结论

参考文献

附录

个人简介

致谢