蒜头果蛋白诱导HepG-2细胞凋亡的研究

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目的:研究蒜头果蛋白诱导肝癌HepG-2细胞增殖抑制及凋亡诱导效应，为蒜头果蛋白的开发利用奠定基础。　　方法:采用蒜头果粉碎、PBS抽提、离心、硫酸铵沉淀、疏水色谱层析从蒜头果种仁中分离纯化出蒜头果蛋白；MTT法检测蒜头果蛋白不同浓度及不同时间对HepG-2细胞的增殖抑制作用；HepG-2细胞形态学观察；DNA凝胶电泳分析不同作用时间蒜头果蛋白作用HepG-2细胞后DNA条带的断裂；流式细胞仪检测不同作用时间蒜头果蛋白作用HepG-2细胞的凋亡峰；流式细胞仪检测不同作用时间蒜头果蛋白作用HepG-2细胞凋亡时线粒体膜电位的变化；分光光度法检测casspase-3、8、9的活性；MTT法检测caspase光谱抑制剂、casspase-3、8、9抑制剂对蒜头果蛋白诱导HepG-2细胞的增殖抑制作用的影响。　　结果:蒜头果蛋白能明显抑制HepG-2细胞的生长，且呈时间剂量关系，当作用24h、48h、72h时其IC50分别为0.2480μg/mL、0.1516μg/mL、0.0739μg/mL；光学显微镜观察发现细胞变圆、固缩、体积变小、细胞间隙增大、有凋亡小体的形成，荧光显微镜观察发现核破碎、呈团块状，荧光强度明显高于对照组；24h时DNA开始出现明显的降解条带，到48h时DNA降解更为明显但已经没有条带存在；12h时线粒体膜电位开始下降，随着给药时间的延长，线粒体膜电位越来越低；caspase-3、8、9的活性随着给药时间的延长而增加，36h时达到最大值；加入caspase广谱抑制剂、casspase-3、8、9抑制剂后，蒜头果蛋白对HepG-2细胞的抑制率明显降低。　　结论:蒜头果蛋白对HepG-2细胞具有明显的时间剂量关系；形态学观察、DNA片段化结果都表明：蒜头果蛋白诱导HepG-2细胞死亡是凋亡性质的细胞死亡；蒜头果蛋白能够使HepG-2细胞线粒体膜电位去极化增强，线粒体功能下降，从而诱导细胞凋亡；给药后caspase-3、8、9活性均明显升高，36h时活性最高，加入caspase广谱抑制剂、caspase-3、8、9抑制剂后，蒜头果蛋白对HepG-2细胞的抑制明显降低，说明caspase家族成员介导了蒜头果蛋白诱导HepG-2细胞凋亡。

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第1章绪论

1.1蒜头果

1.1.1蒜头果简介

1.1.2蒜头果化学成分研究进展

1.1.3蒜头果蛋白（malanin）

1.2肝癌研究进展

1.3细胞凋亡及其信号转导

1.3.1细胞凋亡研究进展

1.3.2细胞凋亡信号传导通路研究进展

1.4课题的提出

第2章蒜头果蛋白的提取

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 蒜头果粗蛋白的制备

2.2.2 蒜头果蛋白的分离纯化

2.2.3 蒜头果蛋白的纯度鉴定

2.3 结果

2.3.1 蒜头果蛋白的分离纯化

2.3.2 蒜头果蛋白纯度鉴定

2.4 讨论

第3章蒜头果蛋白诱导HepG-2细胞凋亡的研究

3.1 实验材料

3.1.1 细胞

3.1.2 药品及试剂

3.1.3 仪器

3.2实验方法