A型流感病毒NS1基因密码子去优化改造引起病毒毒力减弱的研究

摘要

疫苗接种是预防流感最有效的方法，目前投入使用的流感疫苗可分为灭活苗和减毒活苗两大类：灭活苗通过肌肉注射途径免疫，能够诱发机体产生针对血凝素的中和抗体，但无法刺激鼻腔黏膜产生分泌型抗体，也无法诱导产生细胞免疫应答；减毒活苗(冷适应减毒活苗)通过鼻吸入的方式免疫，其免疫的方式更接近自然感染的过程，可充分诱导体液免疫及细胞免疫应答。减毒活苗无论从免疫途径还是免疫效果上都优于传统灭活苗。自反向遗传操作技术建立以来，研究者们尝试过多种方法开发减毒活苗，降低流感病毒毒力，提高其免疫原性，研究出安全有效的减毒活苗已成为新型流感疫苗的发展方向。 在本研究中，我们根据A型流感病毒密码子使用偏嗜性的统计规律，在保留NS片段包装信号和不影响NS1/NS2剪切位点的前提下，选取稀有密码子对A/PuertoRico/8/34(H1N1)病毒NS1基因内部110个氨基酸区域进行密码子同义突变改造，将其替换为病毒使用频率最低的密码子，全基因合成NS基因，利用12质粒反向遗传操作技术拯救出含有密码子去优化NS1基因的重组病毒(deoptimizedNS，deoNS)。MDCK细胞噬斑形成实验表明，病毒在细胞上的成斑能力大大减弱；病毒在MDCK细胞上的生长曲线表明，其在细胞内的复制能力比野生型病毒低约1000倍。BALB/c小鼠体内致病力实验证明，deoNS病毒不能引起小鼠发病和死亡，感染第3天病毒在小鼠肺内的复制滴度比野生型病毒低100倍，感染第5天其在小鼠肺内的滴度比野生型病毒低1000倍。 本研究初步探索了通过基因组密码子去优化改造途径降低A型流感病毒毒力的可行性，首次证明流感病毒NS1基因密码子去优化同义突变可以降低病毒毒力，为流感减毒活疫苗的研究提供了新的思路。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章序论

1.1流感病毒

1.1.1病毒简介

1.1.2病毒的基因组

1.1.3病毒基因组的编码产物

1.1.4病毒的复制

1.1.5病毒抗原性的改变

1.2三次全球流感大流行

1.2.1 1918～1919"西班牙流感"

1.2.2 1957～1958"亚洲流感"

1.2.3 1968～1969"香港流感"

1.3抗流感药物和流感疫苗

1.3.1抗流感药物

1.3.2流感疫苗

第2章前言

2.1流感病毒的反向遗传操作技术

2.1.1流感病毒的反向遗传操作技术的建立

2.1.2反向遗传操作技术在疫苗研究中的应用

2.2密码子改造在脊髓灰质炎疫苗研制中的应用

2.3 NS1基因密码子去优化改造

第3章材料与方法

3.1实验材料

3.1.1 MDCK与293T细胞系

3.1.2质粒与载体

3.1.3病毒和实验动物

3.1.4仪器

3.1.5试剂与试剂盒

3.2溶液配制

3.3实验方法

3.3.1 1％鸡红血细胞悬液的制备

3.3.2病毒扩增

3.3.3 HA血凝检测

3.3.4 EID50测定

3.3.5密码子去优化NS基因的设计与合成

3.3.6 pPOLI-deoNS转录质粒的制备与鉴定

3.3.7 MDCK与293T细胞培养

3.3.8 293T／MDCK混合细胞转染及病毒拯救

3.3.9病毒鉴定

3.3.10噬斑形成实验和免疫染色

3.3.11荧光实时定量PCR

3.3.12小鼠致病力实验

第4章结果与分析

4.1密码子去优化NS1基因的设计及分析

4.1.1密码子去优化NS1基因的设计方案

4.1.2密码子去优化NS1基因的分析

4.2 deoNS病毒的拯救及鉴定

4.2.112质粒的制备和共转染

4.2.2病毒扩增和血凝试验

4.2.3病毒基因组RNA RT-PCR

4.3噬斑形成实验

4.3.1病毒在MDCK细胞上的噬斑实验

4.3.2病毒滴度的测定

4.4病毒在MDCK细胞中生长曲线的测定

4.4.1熔解曲线和标准曲线

4.4.2病毒尿囊液中基因拷贝数的测定

4.4.3病毒在MDCK细胞中生长曲线

4.5小鼠致病力实验

4.5.1 小鼠体重变化

4.5.2 小鼠肺脏病毒滴定

第5章讨论

第6章结论

参考文献

附录

致谢

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