双组分系统RstA/RstB激活外排泵并调节荧光假单胞菌多重耐药性

摘要

【目的】荧光假单胞菌2P24中双组分系统RstA/RstB的功能鉴定及其对微生物多重耐药性影响的分子机制探讨。【方法】利用共适应性分析预测双组份系统RstA/RstB的潜在功能及与其它蛋白的相关关系；采用同源重组技术构建rstA、rstBsensor、rstBkinase、emhABC、cmeAB、mfs 等基因缺失菌株及D52A、D52E单点突变菌株；采用倍比稀释法检测多种抗生素对各菌株的最小抑制浓度；通过qRT-PCR和β-半乳糖苷酶实验检测emhABC与cmeAB基因的转录、表达水平；表达纯化Mbp-RstA、Mbp-D52A、Mbp-D52E及Mbp标签蛋白，分别通过凝胶阻滞实验与DNaseI足迹实验检测分析各蛋白与靶基因启动子区域的结合活性与结合位点；利用高能磷酸化试剂与交联试剂完成相应蛋白的体外磷酸化与体外交联；利用非标定量比较蛋白质组学分析方法及生物信息学分析探究RstA可能参与的生物学过程。【结果】经Cofitness分析发现RstA/RstB双组分系统与细菌外排泵EmhABC及CmeAB存在较强的共适应性。作为荧光假单胞菌2p24中一组尚未被鉴定的双组分系统，我们首次发现RstA/RstB与微生物多重耐药性密切相关，并且可以直接调控激活外排泵 EmhABC 及 CmeAB 的表达，该调控依赖于RstB激酶结构域的催化活性和RstA第52位天冬氨酸的磷酸化，而被磷酸化后的RstA很可能通过形成二聚体完成功能激活。在随后的蛋白质组学结果中，我们发现该双组分系统参与多种细菌生理代谢过程，尤其是对多种胁迫信号的响应，如抗热损伤、缺氧生存、次级代谢产物生成、生物膜形成及有害物质排出等，是一个以抗胁迫为主要功能的全局性转录因子。【结论】RstA/RstB双组份系统是荧光假单胞菌2P24一组重要的感受-应答调控系统，通过复杂机制调控多个外排泵的表达进而影响微生物多重耐药性，同时很可能在多个生理过程中扮演重要角色，作为一个全局性调控因子对微生物在复杂环境中的适应与生存至关重要。本研究为假单胞菌属多重耐药性的研究提供了新的线索，并为新型抗生素或抗生素佐剂的研发提供理论基础。

目录

声明

第一章 前 言

1.1 微生物对环境的应答机制概述

1.2 双组份系统简介

1.2.1 TCS各组份结构与功能

1.2.2 TCS信号转导与反馈调控机制

1.3 微生物多重耐药性概述

1.4 抗生素耐受形成的主要分子机制

1.4.1 抗生素胞内浓度最小化

1.4.2 抗生素作用靶点突变

1.4.3 抗生素作用靶点修饰与保护

1.4.4 直接改变抗生素药物活性

1.5 TCS与多重耐药性

1.6 荧光假单胞菌研究进展

1.6.1 荧光假单胞菌概述

1.6.2 荧光假单胞菌与多重耐药性

1.7 微生物共适应性分析

1.8 本文立意

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2试剂与仪器

2.2 共适应性分析

2.3 基因缺失菌株的构建

2.4 D52A、D52E点突变菌株的构建

2.5 RstA及其突变体蛋白的表达载体构建及表达纯化

2.5.1 RstA、D52A、D52E蛋白表达载体构建

2.5.2 蛋白质的表达和纯化

2.6 蛋白质的体外磷酸化

2.7 凝胶阻滞实验

2.8 DNaseI足迹实验

2.9抗生素最小抑制浓度测定

2.10 细菌总RNA提取和荧光定量PCR

2.11 半乳糖苷酶报告载体的构建及酶活测定

2.12 蛋白质组学样品的制备和数据分析

2.13 蛋白质的化学交联

第三章 结果与讨论

3.1荧光假单胞菌中TCS RstA/RstB与多个外排泵存在共适应性

3.1.1 共适应性分析

3.1.2 荧光假单胞菌2P24中序列分析

3.2 RstA直接影响荧光假单胞菌2P24多重耐药性

3.3 RstA正向调控外排泵EmhABC及CmeAB的表达

3.3.1 RstA调节外排泵的表达

3.3.2 RstA蛋白质与外排泵基因上游调控区互作不显著

3.4 RstA发挥效应依赖于磷酸化

3.4.1 RstA蛋白质经磷酸化与外排泵基因上游调控区互作

3.4.2 RstA经磷酸化的功能激活依赖于D52

3.5 RstB不同结构域对荧光假单胞菌多重耐药性的影响

3.6 RstA以二聚体形式调节外排泵基因的表达

3.7 RstA作为一个全局性转录因子参与调控多个生物学过程

第四章 总结与展望

4.1 主要结论

4.2 研究意义与展望

参考文献

在学期间科研成果

附录

致谢