响应性金纳米药物载体系统用于克服肿瘤细胞耐药性的研究

摘要

肿瘤细胞对化疗药物所产生的耐药性(包括多药耐药，multidrugresistance,MDR)是导致临床治疗失败的重要原因。多数MDR肿瘤细胞其细胞膜存在过表达的P-糖蛋白(P-gp)，可以将许多结构和功能不同的抗癌药物排出胞外。因此，如何规避P-gp的作用是克服此类肿瘤细胞耐药性所亟待解决的重要问题。
　　 本论文的主要内容是针对克服肿瘤细胞耐药性的难题，设计合成响应性金纳米药物载体携载化疗药物阿霉素(DOX)，用于克服肿瘤细胞的耐药性。与小分子药物相比，载药纳米颗粒通过内吞方式进入耐药细胞，不易被P-gp蛋白排出；同时，利用肿瘤组织特殊的病理生理学特征，使载药纳米颗粒能够最大程度到达病灶部位并释放药物，以此提高药物疗效和降低毒副作用。
　　 本论文的工作包括以下几个部分：
　　 1、构建了载有阿霉素的pH响应性金纳米颗粒药物输送系统(DOX-Hyd＠AuNPs)。将金纳米颗粒表面与硫辛酸化的聚乙二醇(PEG)连接，同时在PEG链另一个末端通过对肿瘤细胞内酸性环境敏感的腙键连接抗癌药物DOX，制备了对内涵体/早期溶酶体pH响应的载有DOX的金纳米颗粒药物载体；研究了该载药系统在不同pH的稳定性，发现在中性条件下纳米药物载体稳定，但在酸性（pH5.0左右）溶液中，腙键断裂并释放药物；结合金纳米颗粒对阿霉素荧光的淬灭性质研究了药物的释放行为。
　　 2、以多药耐药肿瘤细胞MCF-7/ADR为模型，使用第一部分合成的DOX-Hyd＠AuNPs作为药物载体研究了其克服肿瘤多药耐药的行为和效果。利用高效液相色谱检测了胞内DOX-Hyd＠AuNPs所携载的DOX的浓度，证明DOX-Hyd＠AuNPs可逃避P-gp对DOX的泵出，使DOX在MCF-7/ADR中富集，同时降低MCF-7/ADR对DOX的排出；进一步通过流式细胞仪、激光扫描共聚焦显微镜等手段，证明DOX-Hyd＠AuNPs通过内吞方式进入细胞，并在胞内酸性环境中，DOX-Hyd＠AuNPs腙键断裂，并释放药物；与游离DOX相比，DOX-Hyd＠AuNPs可显著增强对MCF-7/ADR的DNA损伤以及对细胞的杀伤，有效克服肿瘤细胞的耐药性。此外，发现DOX-Hyd＠AuNPs还可作为荧光探针，对细胞内游离药物进行监测。
　　 3、构建了载有阿霉素的pH响应性金纳米壳药物输送系统(DOX-Hyd＠HAuNS)。通过透射电子显微镜、紫外-可见光谱等手段对DOX-Hyd＠HAuNS进行了表征，并在细胞水平上，利用流式细胞仪等手段，证明DOX-Hyd＠HAuNS更有效地将DOX输送到MDA-MB-231乳腺癌球囊细胞中；进一步研究了金纳米壳光热转化效应与化疗药物是否具有对肿瘤干细胞的协同治疗效果，并通过MTT和球囊形成实验发现，金纳米壳的光热转换增强了DOX-Hyd＠HAuNS对MDA-MB-231乳腺癌球囊细胞的毒性，降低了乳腺癌球囊细胞的“干性”。
　　 4、制备了基于聚己内酯-聚磷酸酯嵌段共聚物(PCL-b-PEEP)的囊泡，研究了其在磷酸二酯酶催化下对包载药物的可控释放。以三异丙醇铝作为引发剂，通过开环聚合的方法合成了PCL-b-PEEP，并利用核磁共振，凝胶渗透色谱等对嵌段共聚物进行了表征；进一步结合薄膜水化和薄膜挤出制备了纳米尺度PCL-b-PEEP囊泡，通过透射电子显微镜、动态光散射、激光扫描共聚焦显微镜等手段表征和证明其囊泡结构；通过pH梯度方法包载阿霉素盐酸盐，载药量为4.38％，发现包载DOX/PCL-b-PEEP的囊泡在磷酸二酯酶催化作用下，140小时内，释放83.8%的DOX，而没有酶存在的情况下，仅释放约30%。通过激光扫描共聚焦显微镜，在细胞水平上研究了DOX/PCL-b-PEEP囊泡内吞进入人肺癌细胞A549的过程，并采用MTT的方法检测了细胞生长抑制效应。

目录

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摘要

第一章 绪论

1.1 癌症治疗

1.2 多药耐药

1.2.1 耐药概述

1.2.2 肿瘤细胞的耐药机制

1.2.3 肿瘤多药耐药的逆转策略

1.3 纳米药物载体

1.3.1 肿瘤被动靶向

1.3.2 肿瘤主动靶向

1.4 响应性纳米药物载体

1.4.1 pH响应性纳米药物载体

1.4.2 还原响应性纳米药物载体

1.4.3 酶响应性纳米药物载体

1.4.4 光敏感纳米药物载体

1.4.5 其它响应性纳米药物载体

1.5 纳米药物用于逆转肿瘤的多药耐药性

1.5.1 纳米颗粒对肿瘤细胞MDR的逆转

1.5.2 运载化疗药物纳米颗粒对肿瘤细胞MDR的逆转

1.5.3 运载核酸药物的纳米颗粒对肿瘤细胞MDR的逆转

1.6 本课题的选题目的及主要研究内容

参考文献

第二章 pH相应性载阿霉素金纳米颗粒的合成

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 原料及试剂

2.2.2 聚合物的表征

2.2.3 α-羟基-ω-氨基聚乙二醇的合成

2.2.4 α-硫辛酰基-ω-羟基聚乙二醇的合成

2.2.5 LA-PEG-NPC的合成

2.2.6 LA-PEG-Hyd的合成

2.2.7 末端通过腙键键合DOX的聚乙二醇的合成

2.2.8 末端通过氨基甲酸酯键键合DOX的聚乙二醇的合成

2.2.9 LA-PEG-Hyd-DOX和LA-PEG-Cbm-DOX在酸性条件下的稳定性

2.2.10 金纳米颗粒的制备

2.2.11 具有pH响应性的载药纳米颗粒(DOX-Hyd@AuNPs)的制备

2.2.12 非pH响应性的载药纳米颗粒(DOX-Cbm@AuNPs)的制备

2.2.13 紫外-可见光谱分析

2.2.14 透射电子显微镜

2.2.15 DOX-Hyd@AuNPs和DOX-Cbm@AuNPs中DOX含量的测定

2.2.16 高效液相色谱法检测DOX-Hyd@AuNPs和DOX-Cbm@AuNPs在不同pH值下对DOX的释放

2.2.17 荧光显微镜观察DOX-Hyd@AuNPs和DOX-Cbm@AuNPs在不同pH值下对DOX的释放

2.2.18 LA-PEG-Hyd-DOX的荧光测定

2.2.19 LA-PEG-Hyd-DOX稳定的AuNPs对DOX的荧光淬灭

2.2.20 DOX-Hyd@AuNPs在不同pH值下DOX的荧光恢复

2.3 结果与讨论

2.3.1 α-羟基-ω-氨基聚乙二醇的合成

2.3.2 α-硫辛酰基-ω-羟基聚乙二醇的合成

2.3.3 LA-PEG-NPC的合成

2.3.4 LA-PEG-Hyd的合成

2.3.5 末端通过腙键键合DOX的聚乙二醇的合成

2.3.6 末端通过氨基甲酸酯键键合DOX的聚乙二醇的合成

2.3.7 LA-PEG-Hyd-DOX和LA-PEG-Cbm-DOX在酸性条件下的稳定性

2.3.8 载药金纳米颗粒的制备和表征

2.3.9 载药金纳米颗粒载药量的计算

2.3.10 金纳米颗粒淬灭DOX荧光的研究

2.3.11 载药金纳米颗粒的pH响应性

2.4 本章小结

参考文献

第三章 pH响应性载阿霉素金纳米颗粒用于逆转肿瘤细胞多药耐药性的研究

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 原料及试剂

3.2.2 细胞来源及培养

3.2.3 逆转录-聚合酶链反应检测肿瘤细胞MDR1基因的表达

3.2.4 蛋白免疫印迹法检测肿瘤细胞P-gp的表达

3.2.5 mPEG稳定的AuNPs的制备

3.2.6 MTT法检测肿瘤细胞对DOX的耐药性

3.2.7 mPEG@AuNPs的细胞相容性评价

3.2.8 高效液相色谱法检测肿瘤细胞对DOX的摄取和外排

3.2.9 流式细胞术检测肿瘤细胞内DOX的荧光

3.2.10 电感耦合等离子体质谱分析肿瘤细胞对金纳米颗粒的摄取

3.2.11 激光扫描共聚焦显微镜观察DOX在肿瘤细胞中的定位

3.2.12 激光扫描共聚焦显微镜观察DOX-Hdy@AuNPs的内涵体逃逸

3.2.13 细胞电镜观察DOX-Hdy@AuNPs在肿瘤细胞内的定位

3.2.14 MTT法检测载药纳米颗粒对肿瘤细胞的毒性

3.2.15 细胞凋亡(DNALadder)

3.2.16 内吞抑制剂对DOX-Hdy@AuNPs进入细胞的影响

3.3 结果与讨论

3.3.1 多药耐药细胞中MDRl基因和P-糖蛋白的过量表达

3.3.2 多药耐药细胞对化疗药物的耐受性增强

3.3.3 载药金纳米颗粒增加耐药细胞对DOX的摄取

3.3.4 载药金纳米颗粒减少耐药细胞对DOX的泵出

3.3.5 DOX-Hyd@AuNPs在胞内快速释放药物

3.3.6 激光扫描共聚焦显微镜观察DOX在肿瘤细胞中的定位

3.3.7 DOX-Hyd@AuNPs增强DOX对MCF-7/ADR细胞的杀伤,促进细胞凋亡

3.3.8 DOX-Hyd@AuNPs增加药物富集的机制研究

3.4 本章小结

参考文献

第四章 pH响应性载阿霉素金纳米壳的光热疗联合化疗抑制肿瘤干细胞“干性”的研究

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 原料及试剂

4.2.2 金纳米壳的制备

4.2.3 金纳米壳的光热转换性质

4.2.4 具有pH响应性的载药纳米壳(DOX-Hyd@HAuNS)的制备

4.2.5 紫外-可见光谱分析

4.2.6 透射电子显微镜观察

4.2.7 DOX-Hyd@HAuNS中DOX含量的测定

4.2.8 球囊细胞培养

4.2.9 流式细胞术检测乳腺癌贴壁细胞和球囊细胞中ALDHhi细胞的比例

4.2.10 MTT法检测乳腺癌球囊细胞的耐药性

4.2.11 流式细胞术检测乳腺癌贴壁细胞和球囊细胞对阿霉素的摄取

4.2.12 MTT法检测近红外光照射载药纳米颗粒对乳腺癌球囊细胞的毒性

4.2.13 球囊形成率实验检测乳腺癌干细胞的“干性”

4.3 结果与讨论

4.3.1 DOX-Hyd@HAuNS的表征

4.3.2 金纳米壳的光热转换性质

4.3.3 流式细胞术检测MDA-MB-231乳腺癌贴壁细胞和球囊细胞的“干性”

4.3.4 DOX-Hyd@HAuNS更有效将DOX输送到MDA-MB-231乳腺癌球囊细胞

4.3.5 近红外光照射增强DOX-Hyd@HAuNS对MDA-MB-231乳腺癌球囊细胞的杀伤

4.3.6 近红外光照射增强DOX-Hyd@HAuNS对MDA-MB-231乳腺癌干细胞“干性”的抑制

4.4 本章小结

参考文献

第五章 聚磷酸酯-聚己内酯纳米囊泡的制备及其用于化疗药物阿霉素的输送

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 原料与试剂

5.2.2 聚合物的表征

5.2.3 聚己内酯大分子引发剂的合成

5.2.4 聚己内酯-聚磷酸酯嵌段共聚物的合成

5.2.5 纳米囊泡的制备

5.2.6 纳米囊泡形貌的表征

5.2.7 纳米囊泡对DOX的包载

5.2.8 载药纳米囊泡对DOX的释放

5.2.9 激光扫描共聚焦显微镜观察DOX在肿瘤细胞中的定位

5.2.10 MTT法检测载药纳米囊泡对肿瘤细胞的毒性

5.2.11 聚合物囊泡的体外降解

5.3 结果与讨论

5.3.1 嵌段共聚物PCL-b-PEEP的合成与表征

5.3.2 嵌段共聚物组装形成囊泡的制备与表征

5.3.3 囊泡包载并在酶促降解作用下释放阿霉素

5.3.4 激光扫描共聚焦显微镜观察DOX在肿瘤细胞中的定位

5.3.5 载药纳米囊泡的细胞杀伤

5.4 本章小结

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果