基于同步辐射的单细胞生物效应红外显微光谱研究

摘要

本论文的研究内容包括两部分：(1)单细胞同步辐射傅立叶变换红外显微光谱研究辐射生物学效应；(2)单细胞衣藻的软X射线透射显微成像的初步研究。
　　 第一部分：单细胞同步辐射傅立叶变换红外显微光谱研究辐射生物学效应。
　　 这部分的主要工作包括对同步辐射软X射线微束装置进行改造和完善，使之适用于活体动物细胞的辐射生物学效应研究。联合使用传统的彗星电泳和同步辐射傅立叶变换红外显微技术检测辐射生物效应以检验辐照平台的可行性。同时验证了同步辐射傅立叶变换红外显微技术在辐射生物效应检测上的优越性。利用显微光谱技术对结肠癌细胞辐射效应进行了系统的研究，给出定性以及定量的分析。进一步使用红外显微光谱技术在单细胞水平上对单基因差异导致的细胞代谢变化进行了研究。
　　 第一章介绍了辐射生物学起源及进展、X射线与物质作用的过程以及辐射效应产生的机理，另外介绍了同步辐射X射线的特点，尤其是同步辐射软X射线的“水窗”波段在辐射生物学研究领域的优势。最后详细介绍了红外光谱产生的机理及其在生物医学领域应用，以及探讨了同步辐射傅立叶换显微光谱技术在辐射生物学效应研究上的可行性。
　　 第二章主要介绍了同步辐射软X射线动物细胞辐照系统，包括同步辐射软X射线微光束装置以及动物细胞生存维持系统。
　　 第三章应用单细胞辐照系统对经典癌细胞系—HeLa细胞进行辐照研究。选择氧元素K吸收边的软X射线对癌细胞进行辐照，通过传统的单细胞凝胶电泳技术对辐照效应进行检验，验证了辐照平台的可行性。同时验证了同步辐射傅立叶变换红外显微光谱技术在单细胞水平上检测辐射生物学效应的可行性，结果表明其可在分子水平上检测胞内多种组分的变化，可实现单细胞水平上对辐射效应的研究。
　　 第四章选择氧元素K吸收边的软X射线对敲除抑癌基因p53的结肠癌细胞HCT116进行多种吸收剂量的辐照研究。用同步辐射傅立叶变换红外显微光谱对辐照的生物学效应进行定性以及半定量的分析，结果表明氧元素K吸收边的软X射线造成了癌细胞DNA、蛋白质以及脂类的含量、结构和构象的改变，反映在辐照之后的细胞内组分特征吸收峰的强度增加、吸收频率发生位移等。其中辐照后，在氨基和羟基的叠加吸收中氨基吸收比重加大，酰胺I带中α螺旋和β转角的含量明显减少、β折叠的总含量增加了1.60％、无规则卷曲的含量增加了近3%，都表明辐照后细胞内蛋白质结构向无序化发展：脂类相关吸收分析结果显示辐照后脂链长度发生了改变，且甲基的含量减小。在剂量效应研究中发现amideI/amideⅡ吸收峰面积比值随着辐照剂量的增加而减小，且DNA相对于蛋白质的含量也随着辐照剂量的增加而减小。
　　 第五章使用同步辐射傅立叶变换红外显微光谱技术对抑癌基因p53敲除前后的单细胞进行光谱分析研究，发现敲除p53基因之后细胞内DNA相对于蛋白质的的含量，蛋白质二级结构组分的含量以及脂类的含量和结构都发生了改变，说明敲除p53基因对细胞内的代谢产生了显著的影响。研究结果表明同步辐射傅立叶变换红外显微光谱具备检测单基因的改变能力，为生物医学以及其他相关单基因诊断提供了新的辅助手段。
　　 第二部分：单细胞衣藻软X射线透射成像的初步研究
　　 利用国家同步辐射实验室软X射线显微术实验平台对莱茵衣藻细胞进行透射全场软X射线成像初步研究，着重探索了成像的实验方法。选择氧元素K吸收边附近的软X射线对莱茵衣藻进行完整细胞的软X射线透射成像，对不同的细胞固定和脱水的处理方式成像结果对比分析，探索适应于本显微系统成像的实验方法。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 辐射效应产生的机理

1.2.1 生命的单位组成

1.2.2 细胞的辐射生物学效应

1.2.3 辐射损伤效应的修复

1.3 细胞辐照效应的检测

1.3.1 细胞存活率的检测

1.3.2 单细胞凝胶电泳

1.3.3 微核率检测

1.3.4 细胞凋亡检测

1.4 抑癌基因p53

1.5 傅立叶变换红外光谱

1.5.1 红外光谱产生的原理

1.5.2 影响红外吸收频率的因素

1.5.3 傅立叶变换红外光谱仪

1.5.4 红外光谱在生物医学中的应用

1.5.5 红外显微光谱

1.5.6 同步辐射傅立叶变换红外显微光谱

1.6 本课题的研究意义和主要内容

参考文献

第二章 同步辐射软x射线单细胞辐射平台

2.1 引言

2.2 同步辐射软x射线显微术实验站

2.3 单细胞辐照微聚焦装置

2.4 活细胞维持系统

参考文献

第三章 宫颈癌细胞的软X射线辐射生物学效应

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 仪器与试剂

3.2.2 细胞培养

3.2.3 辐照样品准备

3.2.4 细胞辐照

3.3 辐射生物效应的检测

3.3.1 单细胞凝胶电泳检测

3.3.2 傅立叶变换显微红外光谱检测

3.4 讨论

3.4.1 细胞辐照

3.4.2 细胞爬片

3.4.3 干燥方式

3.5 本章小结

参考文献

第四章 结肠癌细胞的软X射线辐射效应研究

4.1 前言

4.2 细胞辐照

4.3 单细胞光谱的采集

4.3.1 细胞固定

4.3.2 光谱采集条件

4.4 结果与分析

4.4.1 辐照前后细胞图像

4.4.2 辐照前SFT-I R显微光谱

4.4.3 辐照后SFT-IR显微光谱

4.4.4 辐照SFT-IR光谱定性分析

4.4.5 相对吸收强度变化

4.4.6 核酸相关变化

4.4.7 脂类相关变化

4.4.8 蛋白质酰胺带分析

4.4.9 剂量效应

4.5 本章小结

参考文献

第五章 抑癌基因p53单细胞红外光谱研究

5.1 引言

5.2 实验材料

5.3 细胞培养

5.4 光谱采集及预处理

5.5 结果与分析

5.5.1 光谱定性分析

5.5.2 酰胺I带吸收的定量分析

5.6 结论

参考文献

第二部分:单细胞的衣藻软x射线透射全场成像的初步研究

1.1 引言

1.2 材料与方法

1.2.1 材料

1.2.2 实验方法

1.3 结果与讨论

1.4 展望

参考文献

总结与展望

致谢

在读期间发表的主要论文