肺胞外基质水凝胶治疗大鼠放射性肺损伤的研究

摘要

目的：　　放射性肺损伤（RILI）是胸部肿瘤放疗中常见的并发症。持续存在的炎症反应、氧化应激损伤及后期纤维化是其主要病理生理特点。肺胞外基质（ECM）支架材料是离体肺经过SDS、Triton-X-100等化学灌注的方法洗脱细胞、裂解脂膜后，得到的包含较完整结构和功能的蛋白复合体的细胞外基质成分，对多种细胞学行为具有调节作用。通过进一步研磨、酶消化后将ECM支架材料制成温敏性水凝胶，能黏附于组织局部持续发挥作用。既往研究报道肺胞外基质材料有抑制炎症、氧化损伤及纤维化的作用，为阐明肺ECM对放射性肺损伤是否具有治疗作用，本研究在建立气管注射肺ECM水凝胶治疗放射性肺损伤大鼠模型的基础上，初步观察肺ECM水凝胶对大鼠放射性肺损伤的治疗作用，通过观察肺ECM水凝胶对肺泡上皮细胞间质化过程的影响，对可能的治疗机制进行探讨。　　方法及结果：　　第一部分：肺ECM水凝胶治疗放射性肺损伤大鼠模型的制备方法：　　1.肺ECM制备及组织相容性评价　　脱细胞法制备肺ECM材料，通过HE染色、电镜等检测方法验证脱细胞效率；将ECM制成水凝胶材料，并将一定剂量的水凝胶材料注射到正常大鼠皮下，1周后切除注射点周围组织，免疫荧光染色，观察材料组织相容性。　　2.放射性肺损伤大鼠模型评价　　9只大鼠，分为2组：对照组（正常大鼠，3只）、照射组（6只），单次全肺20Gy照射制备RILI模型，照射后第7天，处死，取肺，HE染色，观察肺组织病理变化。取血清，Elisa法检测TNF-α、IL-6水平变化。　　3.放射性肺损伤大鼠气管内注射肺ECM水凝胶适宜剂量的筛选　　24只RILI大鼠在照射后半小时随机分为4组，环甲膜穿刺法分别注射肺ECM水凝胶0μl、300μl、500μl、800μl，比较各组大鼠注射后半小时内死亡率、动脉血氧分压，以及采用免疫荧光染色法观察材料在气道内的分布情况。　　结果：　　1.脱细胞法成功制备肺ECM支架，HE染色及电镜检查可见有核细胞成分洗脱较彻底，胞外基质三维结构保存完好。肺ECM水凝胶皮下注射1周后观察，材料周围未见明显的炎性细胞浸润。　　2.照射后7天，肺组织HE染色显示：肺间质增厚，细胞浸入增加，局部肺泡腔可见渗出、出血。Elisa法检测结果显示：照射组大鼠血清TNF-α、IL-6分别为（98.79±12.12）pg/ml、（75.67±9.22）pg/ml；对照组大鼠血清TNF-α、IL-6分别为（57.11±9.11）pg/ml、（35.14±4.25）pg/ml，照射组显著高于对照组（P﹤0.05）。　　3.气管注射肺ECM水凝胶300μl或500μl均不会影响大鼠动脉血氧分压（P>0.05），而气管内注射800μl则会造成大鼠动脉血氧分压下降（P﹤0.05），荧光显微镜下观察，300μl、500μl、800μl组均能在肺泡表面观察到带绿色荧光的水凝胶材料分布，而800μl组可见部分水凝胶在气道内滞留。　　第二部分：肺ECM水凝胶对大鼠放射性肺损伤的治疗效果研究　　方法：　　1.肺ECM水凝胶对放射性肺损伤过程中炎症反应的作用　　54只大鼠，随机分为3组：Control组（正常大鼠，n=18）、IR+NS组（照射+气管内注射生理盐水，n=18）、IR+ECM组（照射+气管内注射肺ECM水凝胶，n=18）。于照射后第4、8、16周，每组处死6只大鼠，比较各个时间点各组：肺湿/干重比、肺组织病理变化（HE染色、Masson染色）、血清TNF-α、IL-6、TGF-β1水平（Elisa法）。　　2.肺ECM水凝胶对放射性肺损伤过程中氧化损伤的作用　　54只大鼠，随机分为3组：Control组（正常大鼠，n=18）、IR+NS组（照射+气管内注射生理盐水，n=18）、IR+ECM组（照射+气管内注射肺ECM水凝胶，n=18）。于照射后第4、8、16周，每组处死6只大鼠，取肺，测SOD活性、MDA含量。　　结果：　　1.与IR+NS组比较，在照射后第4、8、16周，IR+ECM组大鼠血清TNF-α、IL-6、TGF-β1水平下降（P＜0.05），肺组织湿/干重比降低（P﹤0.05），HE染色显示肺组织病理改变改善，Masson染色显示染蓝的胶原纤维在肺组织沉积减少。　　2.与IR+NS组比较，在照射后第4、8、16周，IR+ECM组大鼠肺组织中MDA含量减少（P﹤0.05），SOD活力增强（P﹤0.05）。　　第三部分：肺ECM水凝胶对放射诱导的肺泡上皮细胞-间质转化过程　　方法：　　1.肺ECM水凝胶对肺组织上皮间质转化水平变化的作用　　36只大鼠，分为3组：Control组（正常大鼠，n=12）、IR+NS组（照射+气管内注射生理盐水，n=12）、IR+ECM组（照射+气管内注射肺ECM水凝胶，n=12）。于照射后第4、16周，每组处死6只大鼠，取肺，免疫组化染色及western blot检测法比较各组大鼠肺组织中E-cadherin、vimentin、α-SMA水平变化。　　2.肺ECM水凝胶对肺组织中羟脯氨酸含量的影响　　36只大鼠，分为3组：Control组（正常大鼠，n=12）、IR+NS组（照射+气管内注射生理盐水，n=12）、IR+ECM组（照射+气管内注射肺ECM水凝胶，n=12）。于照射后第4、16周，每组处死6只大鼠，取肺，测羟脯氨酸含量变化（碱水法）。　　结果：　　1.与IR+NS组比较，照射后第4、16周，IR+ECM组大鼠肺组织中E-cadherin表达水平均增加，vimentin、α-SMA表达水平均降低（P﹤0.05）。　　2.与IR+NS组比较，照射后第4、16周，IR+ECM组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量减低（P﹤0.05）。　　结论：　　1、放射性肺损伤大鼠环甲膜穿刺气管内注射500μl的肺ECM水凝胶，不会明显降低大鼠的血氧分压或增加大鼠的死亡率，且材料可以较均匀的分布于肺泡表面。　　2、气管内注射肺ECM水凝胶可以抑制放射性肺损伤大鼠全身炎症反应，减轻照射后肺组织局部的炎症、氧化损伤，并减轻后期纤维化。　　3、肺ECM水凝胶能抑制放射性肺损伤大鼠肺泡上皮细胞的上皮间质转化过程，从而减轻肺纤维化的严重程度。这可能是肺ECM水凝胶发挥治疗作用的主要机制之一。

目录

前言

第一部分：肺ECM水凝胶治疗放射性肺损伤大鼠模型制备

1.1 实验材料

1.2 实验器械

1.3 实验试剂

1.4 试剂的配制

2. 实验方法

2.1 肺ECM水凝胶的制备

2.2 肺ECM的初步鉴定

2.3 放射性肺损伤大鼠模型的建立

2.4 动物分组及处理

2.5 动脉血氧分压（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）检测

2.6 组织病理学检测

2.7 免疫荧光染色检测

2.8 血清TNF-α、IL-6检测（Elisa法）

结果

1.成功制备肺ECM

2.肺ECM的初步鉴定

3.组织相容性评价

4.放射性肺损伤大鼠模型的评价

5.肺ECM水凝胶气管内注射的安全性

6.免疫荧光检测生物素标记的肺ECM在大鼠肺内分布情况

讨论

第二部分：肺ECM水凝胶对大鼠放射性肺损伤的治疗效果研究

1.1 实验材料

1.2 实验器械

1.3 实验试剂

2. 实验方法

2.1 制备肺ECM水凝胶

2.2 制备放射性肺损伤大鼠模型

2.3 实验分组及处理

2.4 肺ECM水凝胶治疗

2.5 肺湿/干重比

2.6 肺组织病理学检测

2.7 血清TNF-α、IL-6、TGF-β1水平检测（酶联免疫吸附法）

2.8 MDA/SOD检测

3. 统计学方法

结果

1. 肺ECM水凝胶减轻了放射性肺损伤早期炎症及后期纤维化

2. 肺ECM水凝胶能抑制放疗诱导的血清TNF-α、IL-6、TGF-β1的表达

3. 肺ECM水凝胶能减轻放疗诱导的氧化损伤

讨论

第三部分：肺胞外基质水凝胶对放射诱导的肺泡上皮细胞间质转化过程的作用研究

1. 材料和器械

1.1 实验动物

1.2 实验试剂

1.3 实验器械

2. 实验方法

2.1 动物分组及处理

2.2 免疫组化染色

2.3 western blot检测

2.4肺组织Hyp检测

3. 统计学分析

结果

1. 肺ECM水凝胶减少了肺组织中E-cadherin的表达下降水平

2. 肺ECM水凝胶降低了肺组织中α-SMA的表达水平的升高

3. 肺ECM水凝胶降低了肺组织中vimentin的表达水平的升高

4. 肺ECM水凝胶降低了肺组织Hyp量

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述:放射性肺损伤发病机制的研究进展

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