细胞自噬在UVA致人皮肤成纤维细胞凋亡中的作用研究

摘要

本文从以下几方面进行论述：　　第一部分 UVA对人皮肤成纤维细胞凋亡的影响　　目的:提取、培养、鉴定原代人皮肤成纤维细胞，获得足够的细胞源。从形态学观察不同剂量长波紫外线(UVA)对原代人皮肤成纤维细胞生长的影响，分析照射后成纤维细胞增殖活性随UVA剂量变化的关系，探讨UVA对原代人皮肤成纤维细胞凋亡的影响以及摸索UVA诱导原代人皮肤成纤维细胞凋亡的最佳剂量与时间。　　方法:1.收集2-14岁男性包皮环切术后的包皮，消毒后，将包皮分离，取真皮层;剪碎成糜状，加入胶原酶消化，离心后弃上清，用完全培养基（含87％高糖DMEM、10％ FBS、1％GlutaMAX、1％NEAA、1％青霉素-链霉素溶液）重悬后，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。将细胞进行免疫细胞化学法鉴定，获得了高纯度的细胞源。进行不断的传代，冻存细胞。直接计数法观察细胞的生长情况。2.建立UVA照射成纤维细胞模型，观察细胞形态。细胞以1.5×105 cells/ml密度均匀地接种于6孔板中，待细胞融合度为80％时于SUV-1000日光紫外线模拟器光束下进行照光，设有未照光的对照组、4 J/cm2组、8 J/cm2组、12 J/cm2组、16 J/cm2组、20 J/cm2组、40 J/cm2组、80 J/cm2组，照射后细胞继续放入培养箱中培养，在显微镜下观察不同的时间点细胞的生长变化，并照相记录。3.不同剂量UVA照射后，设有5组:对照组、4J/cm2组、8 J/cm2组、12 J/cm2组、16 J/cm2组，每种剂量设有3个复孔，将细胞继续培养4h加入20ul MTT,150ul DMSO，用酶标仪在490 nm下检测各孔吸光度OD值。4.细胞凋亡的检测设置有5组:对照组、4 J/cm2组、8 J/cm2组、12 J/cm2组、16 J/cm2组。UVA照光后培养4h，加入BindingBuffer、5ul AnnexinⅤ-FITC和5ul PI在流式细胞仪下进行检测。　　结果:1.人皮肤成纤维细胞1-2天贴壁生长，呈纺锤形或者梭形，细胞鉴定发现波形蛋白染色为阳性，经过培养的原代细胞符合人皮肤成纤维细胞的特征。直接计数法发现第3-5天细胞增殖速度较快，处于对数期;第6-7天细胞融合度达80％，生长速度缓慢，处于平台期。2.随着UVA剂量的增加，UVA对人皮肤成纤维细胞的损伤增大，呈剂量依赖关系:照射剂量越大，胞内颗粒增多，细胞皱缩变圆，细胞排列间隙增大，胞质折光性下降。UVA照射成纤维细胞后4h的细胞形态变化较大。3.照射剂量≥8 J/cm2，随着照射剂量的增加细胞增殖活性下降，与对照组相比，有显著性差异(P＜0.01);除对照组与4J/cm2组差异无统计学意义（P＞0.05），其余各组之间有显著差异（F=219.01，P＜0.01）。当UVA的剂量为8 J/cm2时，细胞增殖活性大于85％且细胞状态良好。4.随着UVA照射剂量的增加，成纤维细胞凋亡率逐渐增加。除对照组与4 J/cm2组差异无统计学意义(P＞0.05),12 J/cm2组与16 J/cm2组差异有统计学意义（P＜0.05），其余各组之间具有显著差异（F=106.61, P＜0.01）。照射剂量≥8 J/cm2，与对照组相比，有显著性差异（P＜0.01）。　　结论:1.UVA照射可导致原代人皮肤成纤维细胞形态发生变化，呈剂量依赖性。2.UVA照射原代人皮肤成纤维细胞后，细胞增殖活性受到抑制，UVA剂量越大，活性下降越明显。3.UVA可诱导原代人皮肤成纤维细胞凋亡，细胞凋亡率随UVA强度的增大而升高。　　第二部分 细胞自噬对UVA致人皮肤成纤维细胞凋亡的影响　　目的:观察自噬诱导剂RAPA和抑制剂3-MA对UVA照射原代人皮肤成纤维细胞后细胞活性的改变;明确UVA照射后，自噬与UVA致成纤维细胞凋亡的关系。　　方法:1.实验分为对照组、RAPA组、3-MA组。照光前加入100 nmol/L RAPA和50 umol/L3-MA预先孵育2h,8 J/cm2UVA照射成纤维细胞后继续培养4h，观察细胞形态。2.将细胞接种在96孔板上，每孔约5000个细胞。RAPA组、对照组、3-MA组，每种剂量设有3个复孔，2天后将96孔板置于紫外线模拟器下照光，培养4h后用MTT法检测上述三组的细胞活性。3.按照第一部分类似的方法用流式细胞术检测上述三组细胞凋亡情况。　　结果:1.形态学观察各组成纤维细胞形态:RAPA组最好，对照组次之，3-MA组最差。2.干预后，细胞活性从高到低的顺序依次是RAPA组、对照组、3-MA组;RAPA组和3-MA组分别与对照组比较，具有统计学意义（P＜0.05）;组间有显著性差异（F=23.86, P＜0.01）。3.干预后，细胞凋亡率从高到低的顺序依次是3-MA组、对照组、RAPA组，各组之间具有显著性差异（F=43.70，P＜0.01）。　　结论:1.细胞自噬对UVA照射原代人皮肤成纤维细胞有保护作用，促进自噬可保护细胞形态，提高细胞活性。2.细胞自噬可抑制UVA照射后原代人皮肤成纤维细胞凋亡。抑制自噬，可促进UVA照射后原代人皮肤成纤维细胞凋亡。

目录

摘要

前言

参考文献

第一部分 UVA对人皮肤成纤维细胞凋亡的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 细胞自噬对UVA致成纤维细胞凋亡的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

攻读硕士期间撰写和发表论文情况

UVA致人皮肤成纤维细胞损伤机制的研究进展 综述

声明