AGEs/RAGE通过MAPK信号通路促进大鼠内皮祖细胞向成骨细胞分化

摘要

目的：观察经体外培养的大鼠骨髓来源内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)能否在经诱导培养下向成骨细胞分化,探讨AGEs及其膜受体蛋白 RAGE是否能促进 EPCs成骨分化以及 MAPK信号通路在EPCs成骨分化的发生、发展中所起的作用。　　方法：（1）选取体重为120-150g的大鼠，以颈椎脱臼法快速处死，经75％酒精浸泡消毒后，于超净工作台中分离出双下肢股骨及胫骨，收集骨髓液，用密度梯度离心法从下肢骨髓获取单个核细胞并使用EGM-2MV培养基进行体外培养。分别于第3、7、14d时在倒置相差显微镜下对已贴壁细胞进行细胞形态学观察,在培养第7d时对培养细胞进行双染鉴定，荧光显微镜下观察到的 FITC标记荆豆凝血素I(FITC-UEA-I)和DiI-标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)双染色阳性细胞即为正在分化的EPCs。（2）培养细胞中加入不同浓度AGEs作用7天,提取细胞蛋白检测不同浓度的AGEs作用后EPCs的钙化蛋白表达情况,选定20mg/ml AGEs浓度作为最适浓度后，以10mmol/lβ-甘油磷酸+20mg/ml AGEs干预EPCs7天，免疫荧光法于荧光显微镜下观察细胞表型的变化。使用第二代内皮祖细胞，传代后培养三天，然后分别加入EGM-2MV培养基、含20mg/ml AGEs的EGM-2MV培养基、含10mmol/lβ-甘油磷酸的EGM-2MV培养基、含10mmol/lβ-甘油磷酸+20mg/ml AGEs的EGM-2MV培养基，干预处理7天，western blot观察钙化蛋白表达的变化。（3）设计沉默RAGE的siRNA，构建shRNA，用慢病毒载体进行包装，加入到二代EPCs中，用荧光显微镜观察转染效率以及最适MOI值，提取细胞蛋白，用western blot观察RAGE蛋白变化确定转染效果。将细胞分为对照组、20mg/ml AGEs组、20mg/ml AGEs+空病毒转染组、20mg/ml AGEs+病毒处理组，培育7天，用 western blot法观察细胞钙化蛋白变化。（4）在细胞中加入20mg/ml AGEs，分别于0、5、15、30min时终止干预，提取细胞蛋白，用western blot观察AGEs对磷酸化MAPK通路蛋白的影响。将培养三天的二代EPCs分为三组，即对照组、加入MAPK通路抑制剂组（PD9805950umol/l、SB20358020umol/l、SP60012550umol/l）、DMSO组预处理1h，更换培养基，加入20mg/ml的AGEs处理5min，观察相关蛋白表达变化检测抑制剂作用效果。将细胞分为对照组、AGEs组、AGEs+PD98059组、AGEs+SB203580组、AGEs+SP600125组，其中加入抑制剂组先用抑制剂干预24h，再更换培养基，加入AGEs培养7天，提取蛋白观察细胞钙化相关蛋白的变化。　　结果：（1）从骨髓获取的单个核细胞在体外经EGM-2MV培养基培养后，在第3天时可观察到较多贴壁的体积较大的圆形细胞，第7天时出现集落生长、长梭状、“纺锤样”形态的细胞，经“双染”实验鉴定为正在分化的EPCs，第12-14天时已出现典型的“铺路石”样形态。（2）经β-甘油磷酸+AGEs干预后，EPCs免疫荧光观察下内皮祖细胞的表型明显减低，而成骨样表型明显增多，且提取细胞蛋白行western blot检测到钙化相关蛋白的表达也明显增多。（3）加入AGEs刺激后细胞的RAGE蛋白表达明显增多，经siRAGE慢病毒转染细胞RAGE蛋白表达明显减低，经AGEs处理后，相对于对照组及空载体转染组，慢病毒转染组的钙化蛋白明显减低。（4）经AGEs处理后，EPCs磷酸化ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2表达均有所增加，经抑制剂处理后再用AGEs刺激，MAPK磷酸化蛋白表达明显减低。相较于AGEs对照组，经SB203580、SP600125处理后再用AGEs处理的细胞钙化相关蛋白的表达明显减低，而经PD98059预处理的细胞钙化蛋白表达与AGEs组变化不明显。　　结论：（1）EPCs在特定的环境下可以被诱导向成骨细胞分化，且AGEs可以促进这种分化的过程。（2）AGEs促进EPCs向成骨样细胞转化与其膜受体RAGE有着密切的联系。（3）EPCs被诱导向成骨细胞分化与MAPK通路中的p38 MAPK和JNK通路相关，而与ERK通路无确切联系。

目录

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 实验方法

结果

1 EPCs培养及鉴定

2 不同浓度AGEs对EPCs钙化蛋白的影响

3 免疫荧光法检测细胞表型转化

4 western-blot检测EPCs钙化相关蛋白的表达

5 慢病毒感染及相关干预

5 MAPK通路抑制剂对EPCs钙化蛋白表达影响

讨论

1、EPCs的培养特点及鉴定

2、EPCs的成骨分化

3、AGEs/RAGE轴与EPCs成骨分化

4、MAPK与EPCs成骨分化

结论

参考文献

英文缩略词对照表

致谢

综述:内皮祖细胞成骨分化潜能对动脉粥样硬化的影响

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