胶质母细胞瘤中WDR1的作用机制及易感相关性研究

摘要

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，其中恶性程度及发病率最高者为胶质母细胞瘤。由于胶质母细胞瘤恶性增殖、侵袭性生长及放化疗抵抗等特性，即使手术联合术后放疗及替莫唑胺化疗的标准方案也未能显著改善患者预后，肿瘤几乎百分之百复发，患者不可避免面临致死性病程，中位生存时间仅12-15个月。因此，寻找改善胶质母细胞瘤临床治疗效果的新方法是神经外科当前最迫切的研究方向。　　现有研究认为胶质母细胞瘤的发生发展与基因突变积累及信号通路功能失调密切相关，基于大数据组学的分析，参与其中的多种分子病理机制正被逐步发现，靶向这些异常作用的分子元件为胶质母细胞瘤的治疗提供了新思路。然而，当前大多分子靶向治疗的临床试验结果均表明胶质母细胞瘤患者总体预后未得到显著改善。因此，寻找胶质母细胞瘤恶性增殖、侵袭转移和放化疗抵抗等过程中具有核心作用的新分子靶点显得尤为重要。　　肌动蛋白互作蛋白WDR1参与调节肌动蛋白丝动力学和肌动蛋白依赖的细胞生物学过程，如细胞骨架和细胞间连接的结构与重塑等，在细胞分裂及迁移中具有重要作用。已有研究发现WDR1在乳腺癌、卵巢癌和甲状腺癌等恶性肿瘤中表达明显升高，并促进肿瘤侵袭和迁移，提示WDR1可能作为肿瘤特异性分子参与了肿瘤的发生发展。本研究通过多组学芯片数据筛选发现WDR1在胶质母细胞瘤中表达上调并与患者预后相关，并且利用分子生物学及细胞生物学手段研究了WDR1在胶质母细胞瘤中的功能及信号通路，最后借助流行病学数据分析了WDR1基因遗传变异与胶质母细胞瘤发病风险的相关性。　　第一部分:WDR1在胶质母细胞瘤中表达及与患者预后相关性研究　　目的:通过小样本筛选出胶质瘤中具有预后判断潜能的分子，在多数据库及大样本患者队列中验证目标基因在胶质母细胞瘤中的表达及其在患者预后判断中的作用价值。　　方法:收集14例新鲜胶质瘤样本，提取RNA后行基因芯片检测，根据生存期长短（以60个月为界）筛选出两组患者差异表达基因并行聚类分析。收集TCGA及CGGA数据库胶质瘤患者和正常脑组织基因表达谱数据及临床资料，采用Student-t检验分析筛选出的基因地表达水平在肿瘤和正常脑组织中的差异;Spearman相关性检验分析基因表达水平与胶质瘤病理级别的相关性;Kaplan-Meier曲线分析基因表达水平与胶质母细胞瘤患者预后的相关性。进一步收集100例胶质母细胞瘤和16例正常脑组织样本，构建组织芯片行免疫组化染色，利用Student-t检验、单因素及多因素Cox回归分别验证WDR1在胶质母细胞瘤中的表达及与患者预后的相关性。　　结果:在基因表达芯片数据中，经过p小于0.001并且表达差异大于2倍的筛选，共有83个差异表达基因被筛选出来，其中59个差异基因的表达量在预后较差组中显著上调。将筛选出的差异基因分别在TCGA和CGGA数据库中分析，TCGA数据库显示，与正常脑组织相比，WDR1在胶质母细胞瘤中上调2.2倍(p＜0.001)，并且高表达的WDR1与患者较短的总体生存期(p=0.017，中位生存时间=345天)和无进展生存期(p=0.044，中位无进展时间=186天)均密切相关;CGGA数据库显示，WDR1表达水平随着胶质瘤病理级别增加而升高(p＜0.001)，并且较高的WDR1表达水平与胶质母细胞瘤患者较短的总体生存期（p=0.024，中位生存时间=345天）和无进展生存期(p=0.046，中位无进展时间=240天)显著相关。进一步在自己收集的患者队列中对WDR1进行验证，结果同样发现WDR1在胶质母细胞瘤中较正常脑组织中表达显著升高(p＜0.001)，生存分析显示高表达WDR1与较短的患者总体生存期(p=0.001，中位生存时间=10个月)和无进展生存期（p=0.005，中位无进展时间=8个月）相关，并且是两者独立的危险判断因子(HR=2.147，p=0.001;HR=1.912，p=0.005)。　　结论:WDR1在胶质母细胞瘤中表达明显上调，表达水平与病理级别呈正相关，并且表达量高低是胶质母细胞瘤患者独立的预后判断因子。　　第二部分:WDR1在胶质母细胞瘤细胞中的功能和机制研究　　目的:通过细胞功能学实验明确WDR1在胶质母细胞瘤恶性增殖和侵袭性生长中的功能，探索WDR1表达调控的机制及下游潜在信号通路。　　方法:构建WDR1慢病毒过表达及干扰质粒，包装慢病毒感染胶质瘤细胞系T98G和U87，利用CCK-8和EdU染色检测细胞增殖能力以及Transwell实验检测细胞侵袭能力。构建转录因STAT3过表达载体转染T98G和U87细胞，在IL-6作用下，利用实时荧光定量PCR检测WDR1 mRNA表达变化。构建WDR1基因启动子荧光报告素酶载体及突变载体，与STAT3过表达载体共转293FT细胞，在IL-6作用下，利用双荧光素酶报告系统检测荧光值变化。最后，基于TCGA和CGGA数据库中胶质母细胞瘤表达谱数据进行生物信息学分析，筛选WDR1潜在的下游信号通路。　　结果:脑胶质瘤细胞中验证可见，过表达质粒使WDR1表达明显升高，两条shRNA干扰WDR1效果显著。功能实验结果显示，与对照组相比，过表达WDR1可以显著增加肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，细胞增殖速率加快，EdU染色阳性细胞数明显增多，Transwell发生侵袭细胞数目明显增加;抑制WDR1表达后，细胞则增殖减慢，EdU染色阳性细胞数减少，Transwell发生侵袭细胞数目降低。荧光报告素酶检测结果显示，与突变型WDR1启动子相比，IL-6作用下STAT3可显著增加野生型WDR1启动子的荧光素酶的表达，并且在过表达STAT3的胶质瘤细胞中，WDR1的表达显著升高。生物信息学分析发现，WDR1可能参与调控了细胞粘附、细胞外基质与胞膜受体互作及PI3K-Akt信号通路，从而影响胶质母细胞瘤的恶性进程。　　结论:WDR1基因的表达可以显著影响胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力，STAT3可在转录水平调控WDR1基因的表达;WDR1可能通过细胞粘附、细胞外基质与胞膜受体互作及PI3K-Akt信号通路参与调控胶质母细胞瘤的增殖和侵袭过程。　　第三部分:WDR1基因遗传多态与胶质瘤发病风险的相关性研究　　目的:通过分子流行病学分析WDR1基因遗传多态性与胶质瘤易感性之间的关系。　　方法:收集530例胶质瘤患者（胶质母细胞瘤208例）及524例正常健康人群的血样，记录基本流行病学信息（性别、年龄等），提取血样DNA，通过HapMap数据库分析，筛选标签SNP，并对标签SNP进行基因分型。采用Student-t检验比较连续性变量均值的差异，采用卡方检验比较分类变量的分布差异。非条件逻辑回归分析各位点基因型与胶质瘤发病风险的相关性。　　结果:在收集的530例胶质瘤患者和524例正常健康人群的平均年龄分布为50.83±10.54和46.09±13.18。病例组男性比例为58.7％，对照组中男性比例为60.3％。按照WHO病理级别划分，Ⅰ级患者占2.3％，Ⅱ级患者占37.9％，Ⅲ级患者占20.6％，Ⅳ级患者占39.2％。根据最小等位基因频率(MAF≥0.05)且r2≥0.8的筛选标准，在WDR1基因上下游各延伸2kb范围共发现12个标签SNP，其中rs9926位于基因3，UTR区，rs13441位于基因外显子编码区，可导致异亮氨酸错义突变为缬氨酸，其余位点均落在基因内含子或基因间区。卡方分析发现位点rs3756230、rs734122和rs13441等位基因型在胶质瘤病例组和对照组中分布具有显著差异，p值分别为0.03、0.02和0.02。单位点分析显示，在共显性模型下rs3756230位点GG基因型可以显著增加胶质瘤患病风险(p=0.04，校正后OR值为1.976)，在显性模型下CG+GG基因型与野生型CC相比可显著增加胶质瘤的患病风险(p=0.045，校正后OR值为1.304)，并且趋势分析发现随着G等位基因型的增大，发病风险显著增加(p=0.019，校正后OR=1.303);在共显性模型下rs13441位点TT基因型与野生型TT相比具有降低发病风险的保护作用(p=0.002，校正后OR值为0.541)，趋势分析发现随着T等位型的增多，发病风险显著降低(p=0.007，校正后OR=0.779)。分层分析结果显示，共显性模型下rs13441位点的CT基因型(p=0.043，校正OR=0.615)和TT基因型(p=0.001，校正后OR=0.341)与野生型CC相比可显著降低女性患者胶质瘤的患病风险（p=0.001，校正后OR=0.589），显性模型下CT+TT基因型与野生型CC相比可显著降低胶质瘤的患病风险(p=0.006，校正后OR=0.534)。在病理类型分层分析中，rs13441位点的TT基因型与野生型CC相比可显著降低胶质母细胞瘤的患病风险(P=0.029，校正后OR=0.537)，趋势分析发现随着T等位型的增多，胶质母细胞瘤的发病风险显著降低(p=0.027，校正后OR=0.768)。　　结论:WDR1基因遗传多态性与胶质瘤发病风险显著相关，提示了WDR1基因的遗传背景在胶质瘤发挥作用。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

前言

参考文献

第一部分 WDR1在胶质母细胞瘤中表达及其与患者预后相关性研究

引言

材料和方法

一、材料

二、实验方法

结果

一、基因芯片胶质瘤样本临床信息

二、基因芯片数据分析

三、TCGA和CGGA数据库初步验证

四、组织芯片胶质母细胞瘤样本临床信息

五、WDR1在胶质母细胞瘤及正常脑组织中的表达

六、WDR1表达与胶质母细胞瘤患者预后的相关性

讨论

参考文献

第二部分 WDR1在胶质母细胞瘤细胞中的功能和机制研究

引言

材料和方法

一、材料

二、实验方法

结果

二、WDR1调控胶质母细胞瘤细胞增殖

三、WDR1调控胶质母细胞瘤细胞侵袭

四、WDR1表达受STAT3调控

五、WDR1下游调控机制初步探索

讨论

参考文献

第三部分 WDR1基因遗传多态与胶质瘤发病风险的相关性研究

引言

材料和方法

一、材料

二、实验方法

结果

一、研究对象的临床基本资料

二、SNP位点的选择

三、单位点分析

四、单位点分层分析

讨论

参考文献

综述

博士研究生期间发表的论文和参加科研情况

致谢