力学因素对肝细胞糖原代谢的影响

摘要

目的：　　门脉高压症是肝硬化的常见临床症状之一，常见阻塞原因主要为肝窦和窦后阻塞，假小叶的形成使得原有血液循环通路受阻或改道，压迫血管，限制血液流量。另外，肝窦和窦后阻塞使得淋巴循环受阻，与血液交换减少，进一步造成压力增高。这一过程与肝脏的力学微环境密切相关，但其中的力学生物学机制仍不明确。与此同时，肝脏是参与糖代谢的重要脏器，在维持血糖稳定中具有重要作用。终末期肝病合并门脉高压患者中，肝脏对糖的代谢功能出现障碍，引起血糖紊乱，虽然针对肝糖代谢紊乱的研究有很多，针对细胞外压力对于肝糖原代谢的作用描述及作用机制研究较为少见。因此，在本研究中，通过改造细胞孵化装置给予肝细胞施加细胞外压力，从而模拟肝硬化门脉高压中力学微环境，探索不同细胞外压力条件下肝细胞糖代谢的改变模式，从而初步研究细胞外机械压力在肝细胞糖代谢中的调控机制。　　本研究分为以下三个部分:①探讨细胞外压力对于肝细胞糖代谢的影响;②验证细胞外压力变化是否通过影响肝糖原的合成使肝癌细胞中糖原含量减少;③初步分析哪些上游信号通路参与细胞外压力对于肝细胞糖代谢的影响。　　方法：　　一、不同细胞外压力对于肝细胞内糖原含量的影响　　（一）细胞压力加载　　将在体外培养48小时的HepG2细胞和HL7702细胞按1×104cell/孔密度接种在六孔板上，然后置于压力装置中，通过输入高压氮气并使用测压计观察压力数值，以达到给细胞加载不同压力（0mmHg，5mmHg，10mmHg，15mmHg）的目的，压力加载完毕后将装置置于含有5％CO2的恒温37℃细胞培养箱内孵育24小时。　　（二）糖原检测　　通过PAS试剂盒对完成相应压力加载的HepG2细胞和HL7702进行PAS染色，并在荧光显微镜下进行镜检摄像。利用糖原含量试剂盒对完成相应压力加载的肝癌细胞进行糖原含量检测。　　二、力学因素对肝糖原代谢影响的检测　　在压力装置中放置体外培养48小时的HepG2细胞和HL7702细胞按1×104cell/孔密度接种在六孔板上，而后加压至10mmHg，持续24小时。通过qRT-PCR从mRNA水平检测Gys1、Gsk3β、G6pc3与Agl的表达，通过Western-blot从蛋白水平检测Gys1、p-S641Gys1，、Gsk3β、p-Y216Gsk3β的表达。　　三、RNA-seq对压力加载后的肝癌细胞进行全基因组测序　　对HepG2细胞和HL7702细胞进行压力加载（0mmHg和10mmHg，持续24小时）后，Trozil法抽提总RNA，使用Truseq RNA Sample Preparation Kit V2建立总RNA文库，并通过HiSeq2500进行上机测序，并使用CLC Genomics Workbench分析软件对测序结果进行绘图筛选，使用GSEA分析方法对测序结果进行分析。　　四、力学因素引起肝细胞糖原合成抑制的机制研究　　对于HepG2细胞和HL7702细胞利用压力加载装置进行压力加载（10mmHg，24小时），压力加载完毕后提取细胞总RNA及总蛋白，采用qRT-PCR的方法检测p53、PTEN的mRNA表达，Westem-blot法检测p53、PTEN的蛋白表达水平。　　五、实验数据的统计学分析　　采用统计软件GhaphPad Prism5.0和excel对实验数据进行统计学分析和图片绘制。结果用均数加减标准差的方法表达(x±s)，统计学方法采用LSD方差分析和非配对t检验，其中*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。　　结果：　　一、增加压力会减少肝细胞内肝糖原含量　　HepG2细胞被置于不同压力环境(0mmHg，5mmHg，10mmhg以及15mmHg)24小时后PAS染色结果提示:当细胞外压力从0mmHg增高至15mmHg，细胞糖原含量逐渐降低。当细胞外压力达到15mmHg时，细胞内糖原含量并没有较10mmHg压力时显著减少，这种现象表明细胞外压力作用达到了饱和。同样地，在HL-7702细胞中也发现了相似的情况。糖原含量检测结果显示:当压力增加时，HepG2和HL-7702细胞内的糖原浓度均呈逐渐下降趋势，当压力达到10mmHg时，糖原含量显著减少;而当压力达到15mmHg时，糖原减少程度较10mmHg无显著改变。　　二、增加细胞外压力通过调节Gsk3β磷酸化作用从而减少糖原合成　　根据前期研究和第一部分实验结果，在后续实验中使用0mmHg和10mmHg两种压力环境。通过qRT-PCR评估同肝糖原代谢相关的Gys1、Gsk3β、Agl、G6pc3、Pygl的mRNA表达情况。在经过24小时0mmHg及10mmHg压力作用之后，相关基因的表达情况无明显改变。通过western blotting检测发现，GS的总蛋白水平维持未变，然而，在细胞外力为10mmHg情况下，p-S641GS蛋白水平显著降低。p-Y216Gskβ的蛋白表达增强，提示Gsk3β活性增高。因此，这些实验结果提示压力通过增高Gsk3β活性抑制糖原合成。　　三、增加细胞外压力能激活p53/Pten途径　　通过RNA-seq实验进行全基因组表达分析，以分析经过24小时不同压力（0mmHg和10mmHg）作用下的HepG2细胞中全基因组基因表达的改变。10mmHg压力下的基因表达情况明显不同于0mmHg。在HepG2细胞内已定位的13456种基因中，发现了2253种有差异表达的基因，其中包含949种下调基因和1304种上调基因。通过GSEA分析实验数据。结果显示，在众多糖原代谢相关基因中，对Gsk3β有调控作用的p53和Pten的表达显著增加，提示了增加机械压力能通过激活p53/Pten途径从而抑制肝细胞糖原合成。　　四、验证RNA-seq结果　　在进一步的实验中，在孵化于压力条件（0mmHg和10mmHg）下的HepG2和HL-7702细胞株内，验证p53、Pten的基因表达情况。当细胞外压力增加时，p53和Pten的mRNA水平也相应上升。而Western-blot结果提示p53、PTEN在蛋白水平表达增强，进一步证实了细胞外压力通过调控p53/Pten通路，从而对肝细胞糖原合成进行调节。　　结论：　　1.在压力作用下，肝细胞能通过抑制糖原合成，从而降低糖原含量。　　2.细胞外压力通过增强GSK3β中Y216位点上的磷酸化表达，促使Gsk3β活性增高并抑制肝糖原合成。　　2.进一步的研究显示力学因素能调控p53/PTEN通路，并以此调节肝细胞糖原合成。

目录

声明

摘要

缩略词简表

前言

参考文献

第一部分细胞外压力对于肝细胞糖代谢的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

第一部分小结

参考文献

第二部分细胞外压力通过GSK3β活性调节肝糖原合成

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分小结

参考文献

第三部分：细胞外压力抑制肝糖原合成的上游信号通路的初步探索

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分小结

参考文献

全文总结

综述三维培养条件下生物力学响应的lncRNA在肝癌发生发展中的作用及机制

在读期间参加科研工作说明

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