间充质干细胞来源外泌体用于骨修复的研究

摘要

随着当今社会交通业和工业的发展，骨折这种常见的临床损伤正在呈现逐年增高的趋势。高能量损伤导致的骨折常常伴有骨质的缺损和严重的软组织损伤，因此，常常伴有骨折延迟愈合和骨不连的发生。骨折延迟愈合和骨不连是骨折的常见并发症，大约5％-10％的骨折患者会发生延迟愈合或者最终演变为骨不连，从而严重影响患者的生活质量。骨不连的治疗是一个棘手的临床问题，目前常用的方法有保守治疗和手术治疗。保守治疗的方法包括物理治疗（电磁、超声、冲击波等）、分子生物治疗和中医中药治疗，然而实际应用疗效较差。手术治疗的方法包括髓内钉手术（适用于无菌性的长骨骨不连）、钢板内固定术（稳定骨缺损断端）和自体骨移植手术等。通常针对骨不连发生的原因，综合以上方法来进行联合治疗。相对于保守治疗，手术治疗疗效较好，但费用高、创伤大，患者一般不易接受。然而，无论是保守治疗还是手术治疗，仍然存在有一些骨不连无法治愈，这给患者及其家庭带来了极大的痛苦和负担。因此，寻找一种没有手术创伤而且疗效肯定的治疗方式成为了创伤骨科研究领域的一项重点问题。　　干细胞移植治疗是一种先进的医疗技术。它利用干细胞的多向分化潜能和自我复制能力来修复组织的损伤，一直以来都是创伤治疗领域研究的热点方向。间充质干细胞是一类来源于中胚层的，具有多项分化潜能的多能干细胞，其中的骨髓间充质干细胞(BMSC)在骨愈合方面普遍认为具有重要意义。但是利用自体BMSC移植来治疗骨不连具有一定的风险（分化不良或致瘤），并且其治疗周期过长（需要取患者自体骨髓细胞进行分离、培养、扩增、传代）。应用同种异体BMSC进行治疗也受限于缺乏捐献，资源短缺。且异体移植的排异反应等安全性因素也尚未明确。以上这些因素均大大影响了BMSC在骨不连临床治疗研究中的应用。而且现行的国内干细胞治疗管制政策也很难保证干细胞移植策略在近期内获得临床批准。　　因此，寻找一种间充质干细胞的替代物，具有间充质干细胞的分化与增殖特性，且贮存方便、利用快速、治疗周期短的治疗方法是当前医学研究领域的一项热点和难点。在过去，常常认为间充质干细胞是在损伤部位通过分化为所需要的组织细胞来完成修复过程的。然而，近期的研究表明，间充质干细胞由其移植后的定植部位到达损伤部位的数量、所占比例都非常有限，而且移动到损伤部位后分化为组织细胞后存活的时间也非常短，通常分化完之后就会很快凋亡。其真正发挥作用的是干细胞的旁分泌机制。近期的大量研究认为，旁分泌机制是间充质干细胞发挥其移植后修复功能的重要方式，其分泌的带有细胞内遗传信息的RNA及蛋白质等物质作用于损伤部位，从而达到修复的目的。在这些间充质干细胞所分泌的物质中，外泌体(exosome)被认为具有重要作用。　　30多年前，科学家在研究羊的网织红细胞成熟过程中的分泌的囊泡时发现了外泌体，一开始，研究者们只是将这种直径在40-100nm之间，具有脂质双分子层囊泡膜的微小颗粒当做是细胞清理胞质内废物的“垃圾桶”。但是，随着对细胞旁分泌机制的深入研究，逐渐发现外泌体中携带有大量细胞特异表达的蛋白、脂质、核酸等物质，它可以通过“胞吞”或“胞吐”作用通过细胞膜，在不同的细胞间进行物质和信息的传递，发挥重要的生物学功能。　　通过查阅文献以及一些前期的研究，我们发现外泌体在影响细胞的增殖、迁移、分化等过程中均具有重要的作用。外泌体可以对心血管系统、呼吸系统、神经系统、泌尿系统等多种损伤进行修复，且外泌体在一些疾病的诊断方面也有应用。相对于干细胞来说，外泌体具有可以大量生产、贮存、免疫源性低等优点。已有MSC来源的外泌体促进其周围相邻细胞增殖的报道，提示MSC分泌的外泌体内可能含有调控MSC增殖的关键性物质。　　目的：间充质干细胞来源的外泌体在心血管疾病、急性肾损伤、免疫系统疾病、神经系统疾病及一些肿瘤的诊断和治疗中均能发挥积极有效的作用，而外泌体是否能应用于骨损伤的修复并未见到报道。本课题的目的在于探索间充质干细胞来源的外泌体在骨损伤修复方面的作用，为后续的分子生物学及细胞学机制研究打下基础。在本研究中，我们首先建立了人脐带间充质干细胞(uMSC)来源外泌体的制备工艺，通过超速离心法提取了uMSC来源的外泌体。然后利用制备好的外泌体及SD大鼠的BMSC细胞片对动物骨折模型分别进行治疗，通过比较治疗效果，初步明确了间充质干细胞来源的外泌体在骨修复方面的作用，探讨了外泌体应用于骨损伤修复治疗的可行性。　　第一部分：脐带间充质干细胞来源外泌体的制备及鉴定　　方法：(1)原代分离并培养uMSC，利用梯度超速离心法收集早代uMSC分泌的外泌体（P2和P3）。(2)通过电子显微镜直接观察、纳米粒子径粒分析系统、微流式成像系统对外泌体进行鉴定。　　结果：利用电子显微镜观察到了外泌体的整体形态，外泌体的大小和其表面特异标志物通过纳米粒子径粒分析系统和微流式成像系统得到了证实：应用梯度超速离心法得到外泌体在各方面的表征符合目前公认的对外泌体的描述。　　结论：梯度超速离心法是一种简单有效的提取外泌体的办法。通过这种方法制备的外泌体其性状可靠。　　第二部分：SD大鼠BMSC的分离培养与动物骨折模型的建立　　方法：(1)选取2-3只SPF级SD大鼠，处死后取其股骨和胫骨，应用“骨髓法”和“骨片法”分离培养原代(P0)BMSC，传代扩增至第四代(P4)。(2)通过显微镜观察P0和P4BMSC的细胞学形态;通过流式细胞学检测来进行大鼠BMSC的鉴定。(3)SD大鼠骨折模型的建立：利用电锯横断大鼠胫骨，使用0.88mm克氏针髓内固定。　　结果：(1)通过“骨髓法”和“骨片法”分离培养的大鼠BMSC经传代扩增后，形态学观察为纺锤状，呈漩涡状或辐射状排列。流式细胞仪检测显示培养扩增后的BMSC高表达CD29、CD44，低表达CD34。(2)SD大鼠胫骨骨折内固定后，状态稳定，无感染脱落样本。　　结论：(1)通过“骨髓法”和“骨片法”分离培养的细胞与BMSC的形态和表型相符，说明我们获得了较为均一的BMSC细胞系。(2)SD大鼠骨折模型建立成功，可进行进一步的实验研究。　　第三部分：间充质干细胞来源外泌体在骨损伤修复方面的研究　　方法：12只SD大鼠构建胫骨骨折髓内钉固定模型，随机分为4组，空白对照组，PBS处理;uMSC-外泌体组，uMSC分泌的外泌体处理;uMSC上清组，uMSC上清处理;BMSC细胞片组，BMSC细胞片处理。通过micro-CT检测，组织切片染色，qRT-PCR检测成骨标志基因的表达水平三种方法来评价术后3周骨折缺损的愈合情况。　　结果：通过micro-CT分析，组织切片染色，qRT-PCR检测显示，uMSC-外泌体组和BMSC组的骨折愈合明显快于空白对照组和uMSC-exosome上清组，uMSC-外泌体组与BMSC组的愈合效率基本相同。　　结论：uMSC分泌的外泌体在骨修复方面具有积极的作用，其效果近似于BMSC的治疗效果。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分：脐带间充质干细胞来源外泌体的制备及鉴定

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

第二部分：SD大鼠BMSC的分离培养与动物骨折模型的建立

一、前言

二、材料及方法

三、结果

四、讨论

第三部分：间充质干细胞来源外泌体在骨修复方面的研究

二、材料及方法

三、结果

四、讨论

小结

综述

参考文献

发表论文及参加科研工作情况

致谢