LncRNA--MALAT1靶向miR--146b调控新生隐球菌诱导THP--1细胞炎症反应机制研究

摘要

目的:　　隐球菌是一种环境中存在的致病性真菌，通过吸入途径感染，一般在免疫缺陷人群多见，是移植病人的三大深部真菌感染的病因之一。最常见的隐球菌病是隐球菌性脑膜炎，多由新生隐球菌引起，发病隐匿，发展快，目前治疗手段有限且副作用大，整体预后较差，所以还需要进一步寻找诊断与治疗的新方法。　　miRNA作为老牌的非编码RNA，从九十年代开始便在调控基因表达方面受到了人们的重视。单核细胞是人体固有免疫的重要组成部分，研究miRNA在单核细胞系的作用机制对了解人体炎症与免疫反应的内在过程非常重要。而lncRNA对miRNA的调控是近年来的热点，它有可能成为靶点治疗的一种途径，本课题对lncRNA-MALAT1靶向miR-146b从而负向调控TRAF6/p-Akt通路的研究可能为更早期的诊断与副作用更小的治疗提供理论依据。　　方法:　　第一部分，培养THP-1细胞及新生隐球菌WM148。先使用佛波酯PMA使THP-1细胞激活为巨噬细胞，分别设0h（对照组），3h，6h，12h，24h，48h六个时间点，用灭活新生隐球菌WM148诱导激活后的THP-1细胞，分别在相应时间点离心收取细胞及上清液。细胞沉淀提取总RNA并逆转录后，使用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测TNF-α、IL-6的变化趋势。使用ELISA检测细胞因子TNF-α及IL-6的浓度变化，从而确定新生隐球菌干预人单核巨噬细胞THP-1细胞产生炎症反应最明显的最佳时间点。　　第二部分，miR-146b对TRAF6/p-Akt信号通路的调控作用。1、使用荧光素酶报告基因系统检测miR-146b与肿瘤坏死因子受体相关因子TRAF6的关系。2、使用qRT-PCR在基因层面上验证miR-146b对TRAF6及TRAF6/p-Akt信号通路下游的基质金属蛋白酶MMP9的抑制作用，并加入miR-146b的模拟物mimic以及抑制物inhibitor转染，进行反向验证。3、使用蛋白质免疫印迹技术(Western Blot)在蛋白质层面上对miR-146b与TRAF6以及MMP9的调控关系进行验证，并同样用miRNA的模拟物、抑制物转染后重复实验以验证结果的准确性。　　第三部分，现有荧光素酶报告基因系统（肝细胞癌）提示lncRNA-MALAT1抑制miR-146b，使用qRT-PCR进行验证，再使用lncRNA-MALAT1的smart silencer（siRNA及ASO的沉默复合体）重复实验，反向验证结果。　　结果:　　第一部分:在qRT-PCR检测中可以看到，TNF-α在新生隐球菌诱导后含量逐步上升，在6h组达高峰且变化具有统计学意义(P＜0.05)，而后12h、24h及48h组均下降。IL-6的趋势与TNF-α相同，于6h组表达量最高，但上升幅度无统计学意义。而ELISA检测发现，TNF-α先迅速上升后逐渐下降，在6h处表达量最高，升高具有统计学意义(P＜0.01)，趋势呈“倒V”形。IL-6的表达趋势与TNF-α一致，但不同批次间表达量差异较大，升高无统计学意义(P＞0.05)。　　第二部分:1、hsa-miR-146b-5p能够引起TRAF6的3'UTR活性下降，将TRAF63'UTR进行突变后，同样作用下3'UTR活性较野生型增高，差异具有统计学意义(P＜0.01)，说明突变位点可能是miR-146b的作用位点。2、在qRT-PCR实验中，经灭活WM148诱导6h的实验组中，TRAF6及MMP9表达升高;miR-146b mimic组TRAF6及MMP9的上调被抑制，miR-146b inhibitor组明显上升，升高具有统计学意义(P＜0.01)。3、在Western Blot实验中，TRAF6在实验组浓度增高，在miR-146bmimic组中表达减少，在miR-146b inhibitor组中浓度明显增高。　　第三部分:使用qRT-PCR技术检测，实验组中lncRNA-MALAT1表达上升，转染Smart Silencer48小时后，lncRNA-MALAT1表达明显受抑制。沉默MALAT1后再次检测发现miR-146b表达增高，而TRAF6及MMP9升高受到抑制。Western Blot结果显示，TRAF6在WM148诱导6h的实验组中较对照组表达升高，在Smart Silencer组上升受到抑制。　　结论:　　在新生隐球菌感染THP-1细胞时，TRAF6、MMP9表达上升，导致了感染的发展、血脑屏障的破坏。miR-146b可抑制TRAF6表达，从而负向调控TRAF6/p-Akt信号通路，并减少通路下游的MMP9的表达。LncRNA-MALAT1对miR-146b存在“海绵”吸附作用（即lncRNA竞争性结合miRNA，从而对后者起抑制的作用），MALAT1在隐球菌感染中的表达上升，可能是抑制miR-146b表达，促使隐球菌性脑膜炎发生的机制。

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摘要

缩略词表

前言

第一部分隐球菌诱导THP-1细胞炎症反应时间点筛选

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第二部分miR-146b对TRAF6／p-Akt信号通路的调控机制

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第三部分LncRNA-MALAT1对miR-146b的调控作用

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

总结

参考文献

文献综述

发表论文与科研工作

致谢