分泌白细胞介素-35的Breg细胞在慢性HBV感染中的作用

摘要

背 景：慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染严重危害人类的健康。慢性 HBV 感染发生发展的基础是HBV持续复制和病毒特异性T细胞功能障碍导致的宿主清除HBV能力下降，从而诱发肝组织发生特异或非特异性免疫损伤。调节性 B 细胞（Breg）是一种新的 B 细胞亚群，通过分泌 IL-10、转化生长因子-β1（TGF-β1）和白细胞介素-35（IL-35）等细胞因子抑制获得性免疫介导的炎症反应发生发展。这种B细胞在感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤发生发展中发挥重要作用。目前关于分泌IL-35的Breg细胞（i35-Breg）在慢性HBV 感染中的作用及机制尚罕见报道。　　目 的：（1）通过检测慢性HBV感染者外周血i35-Breg细胞及其效应因子IL-35水平同慢性HBV感染者病毒水平和肝脏炎症程度关系，初步明确i35-Breg和 IL-35在慢性HBV感染进程中作用；（2）通过分析初治慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血i35-Breg 和 IL-35 同不同效应 T 细胞亚群比例及其效应因子水平相关性，初步探讨i35-Breg和IL-35参与慢性HBV感染进程机制；（3）通过流式细胞技术鉴别慢性HBV感染进程中 i35-Breg 特异性细胞表型，为进一步探讨 i35-Breg 免疫调节机制提供基础。　　研究方法：第一部分：应用酶联免疫法（ELISA）和流式细胞术分别对35例慢性HBV感染者、15名健康对照者(HC)和17例接受普通干扰素抗病毒治疗的HBeAg阳CHB患者外周血IL-35水平和i35-Breg细胞比例进行检测，分析i35-Breg细胞比例及IL-35水平同病毒学和血清学指标相关关系；第二部分：采用胞内细胞因子染色流式细胞术以及高通量液相蛋白芯片多因子检测法对初治CHB患者外周血i35-Breg、Th1、Th2、Th17细胞比例及其效应因子IL-35、IFN-γ、IL-4、IL-17进行检测，分析i35-Breg细胞和IL-35同不同效应性T细胞比例及其效应因子水平相关性；第三部分：采用胞内细胞因子染色流式细胞术对慢性HBV感染进程中i35-Breg细胞进行表型鉴定。　　结果：第一部分：慢性 HBV 感染者外周血 i35-Breg 细胞比例明显高于 HC （3.45%±3.71% Vs 0.78%±1.56%，P=0.0016），其效应因子IL-35水平也明显高于HC （10.96±3.97 Vs 1.27±0.52，P=0.02）。HBeAg阳性CHB外周血i35-Breg水平明显高于HC（4.081%±4.12% Vs 0.78%±1.56%，p＜0.05），且其外周血IL-35水平（19.34±27.60 ng/mL）明显高于HBeAg阴性CHB(1.68±1.505 ng/mL)和HC(1.26±2.00 ng/mL)，P值均＜0.05。慢性HBV感染者外周血IL-35水平同HBV DNA水平正相关（r=0.11,P=0.04）。慢性HBV感染者外周血i35-Breg细胞水平和其效应因子同肝脏炎症活动负相关,但i35-Breg水平同门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平具有明显正相关（r=0.18,P=0.03）。干扰素治疗早期HBeAg阳性CHB外周血IL-35水平呈下降趋势，但无统计学差异；持续病毒学应答（SVR）组基线IL-35水平低于部分应答或原发无应答组，但无统计学差异。　　第二部分：CHB 患者外周血 i35-Breg 细胞同 CD4+ IL-17+T 细胞比例无相关性（r=-0.362，P=0.116），同CD4+IFN-?+T细胞比例呈负相关（r=-0.555，P=0.011）；同CD4+ IL-4+T细胞比例成正相关（r=0.593，P=0.006）；同CD8+ IL-4+T细胞比例无相关性（r=0.354，P=0.126）；同CD8+IFN-?+T细胞比例成负相关（r=-0.587，P=0.007）；同CD8+IL-17+T细胞比例无相关性（r=0.184，P=0.438）。初治CHB患者外周血IL-2、IFN-?、IL-17水平低于HC（P＜0.05），IL-4、IL-21水平同HC差异无统计学意义。初治CHB患者外周血IL-35同IFN-?水平无相关性（r=-0.243，P=0.100）；同IL-2水平无相关性（r=-0.052，P=0.691）；同IL-4水平成正相关（r=0.272，P=0.035）；同IL-17成负相关（r=-0.283，P=0.020）；同IL-21无相关性（r=-0.163，P=0.203）。　　第三部分：CD19+CD24+CD38+B细胞是慢性HBV感染进程中主要i35-Breg细胞表型，分泌IL-35的CD19+CD24+CD27+B细胞比例则很低。　　结论：i35-Breg细胞及其效应因子参与慢性HBV感染进程，与HBV感染持续相关；i35-Breg细胞抑制Th1水平，促进Th1向Th2转化，并抑制病毒特异性T细胞功能，其效应因子IL-35抑制IL-17分泌，促进IL-4分泌，在一定程度上促进了Th1/Th2失衡；CD19+CD24+CD38+B细胞是慢性HBV感染进程中主要i35-Breg细胞表型。

目录

声明

缩略词表

前言

一、慢性HBV感染严重危害人类健康，缺乏治愈策略

二、宿主免疫反应决定 HBV 感染结局，免疫机制研究为治疗策略提供依据

三、Breg细胞参与慢性HBV感染进程，但机制不完全清楚

四、研究目的与意义

第一部分 分泌白细胞介素-35的Breg细胞和白细胞介素

一、材料

（一）研究对象

（二）主要试剂和仪器

二、方法

（一）检测方法

（二）外周血i35-Breg流式检测

（三）细胞因子IL-35检测

（四）数据处理与统计学分析

三、结果

（一）慢性HBV感染者外周血IL-35高表达，i35-Breg比例增加

（二）慢性HBV感染者外周血IL-35和i35-Breg同HBV感染进程关系

（三）慢性HBV感染者外周血IL-35水平和i35-Breg水平同肝脏炎症程度关系

（四）HBeAg阳性CHB患者干扰素治疗早期外周血IL-35水平

四、讨论

第二部分 分泌白细胞介素-35的Breg细胞同T细胞亚群比例相关性分析

一、材料

（一）研究对象

（二）主要试剂和仪器

（三）溶液配置及存储

二、方法

（一）病毒学和生化学检测

（二）外周血单个核细胞的分离、冻存与复苏

（三）胞内细胞因子染色

（四）高通量液相蛋白芯片检测细胞因子浓度

（五）数据处理与统计分析

三、结果

（一）IL-35+Breg细胞同T细胞亚群比例相关性

（二）CHB患者和健康对照者不同T细胞效应因子水平比较

（三）i35-Breg细胞效应因子IL-35同不同T细胞效应因子相关性

四、讨论

第三部分 慢性HBV感染进程中分泌IL-35的Breg细胞主要表型鉴定

一、材料

（一）研究对象

（二）主要试剂和仪器

二、方法

（一）病毒和生物化学检测

（二）外周血单个核细胞的分离、冻存与复苏

（三）胞内细胞因子染色

三、结果

四、讨论

总结

参考文献

综述:调节性B细胞与乙型肝炎慢性化的研究进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢