P-gp高低表达MCF7全二维细胞膜色谱的构建与中药抗乳腺癌成分的筛选研究

摘要

乳腺癌(breast cancer,BC)是女性常见的恶性肿瘤，伴随着较高的致死率，BC的治疗引起人们的广泛关注。常规的治疗手段有手术、放疗和化疗，但是会引起各种不良反应，以及后续引发的多药耐药现象(multidrug resistance，MDR)，对患者的身体健康和生活质量产生不良影响。中药治疗以其多靶点作用、辨证施治、整体调理等特点在BC的治疗过程中可以发挥重要的辅助作用，目前已经有一些中药单体或复方应用于BC临床治疗，但是仍旧主要依赖于广大医生的临床经验，发挥其抗乳腺癌药效的机制仍不清楚。因此，从中药中快速筛选出其中发挥药效的活性成分，并对其机制进行研究是十分重要的工作。　　细胞膜色谱(cell membrane chromatography,CMC)是从上世纪九十年代开始发展迅速的一种生物亲和色谱技术，以细胞膜和硅胶载体作为固定相，采用色谱分析的方法，可在体外模拟小分子化合物与细胞膜受体的相互作用过程。细胞膜色谱法将成分分离与活性筛选相结合，具有操作方便、快速稳定，灵敏度高等优点，尤其适用于中药等复杂成分体系的活性筛选。　　本课题的主要研究内容分为以下三个部分:　　1、P-gp高低表达的MCF7和MCF7/ADR全二维细胞膜色谱系统的构建　　以MCF7和MCF7/ADR两株细胞为研究对象，用流式细胞术和Western Blot方法验证MCF7细胞膜表面P-gp呈低表达水平，MCF7/ADR细胞株呈高表达水平，且无药培养两周后表达水平并没有发生显著变化。搭建了经APTES修饰的MCF7和MCF7/ADR-C18柱/TOF-MS全二维细胞膜色谱系统，同时构建硅胶色谱柱和经APTES修饰的硅胶色谱柱全二维分析系统作为参比，进行系统的有效性和专属性考察。系统有效性考察结果显示，吉非替尼在硅胶色谱柱和经APTES修饰的硅胶色谱柱上没有保留行为，但是在MCF7和MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有显著的保留行为;相应的，地塞米松在四种色谱柱上均没有表现出任何保留行为，证明该系统有效性良好。系统的专属性考察结果显示，Tariquidar在硅胶色谱柱、经APTES修饰的硅胶色谱柱和MCF7细胞膜色谱柱上没有显著的保留行为，但是MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有显著的保留行为，显示该系统有一定的专属性。可以用于筛选中药中抗乳腺癌潜在活性化合物。　　2、基于全二维乳腺癌细胞膜色谱法对中药抗乳腺癌活性成分的筛选　　首先选择了八种有抗乳腺癌作用的中药材作为对象，构建其化学成分库，制备了中药提取液，并用HPLC/TOF-MS系统对中药提取液进行了分离和分析，并且为后续的全二维分析提供第二维分离的优化条件。应用经APTES修饰-MCF7/CMC-C18/TOF-MS和经APTES修饰-MCF7/ADR/CMC-C18/TOF-MS全二维分析系统实现对八种中药中抗乳腺癌潜在活性成分的筛选，结果显示，大黄和黄芩保留成分较多，保留行为较好，因此继续以大黄和黄芩为研究对象，完成了保留成分全二维等高线图谱的绘制和TOF-MS初步鉴定结果表，并用标准品进行了验证。结果显示，大黄提取液在MCF7细胞膜色谱柱上共有14种保留成分，在MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有15种保留成分，其中在两株细胞都有保留的成分有10种，并对其中食用大黄苷、大黄酚、丹叶大黄素、大黄素甲醚、云杉鞣酚和大黄素六种成分进行了验证。黄芩提取液在MCF7细胞膜色谱柱上共有15种保留成分，在MCF7/ADR细胞膜色谱柱上有14种保留成分，其中在两种细胞膜色谱柱都有保留的成分有10种，并对其中的汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A、黄芩素和汉黄芩苷五种成分进行了验证。为下一步潜在活性成分的药效验证研究和活性成分与P-gp之间关系研究奠定了良好的基础。　　3、潜在活性成分抗乳腺癌活性及其与P-gp的关系研究　　根据全二维MCF7和MCF7/ADR细胞膜色谱系统对中药大黄和黄芩的筛选结果，选择其中可获得11个化合物为对象。首先对其潜在抗乳腺癌的作用进行体外增殖抑制的药效验证，结果显示，大黄中丹叶大黄素、云杉鞣酚和大黄素，黄芩中汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A和黄芩素对MCF7和MCF7/ADR两株细胞均有一定杀伤作用，且对两株的敏感性不同。进而采用流式细胞术考察它们是否通过细胞凋亡这个途径发挥其杀伤作用。结果显示，丹叶大黄素、云杉鞣酚、汉黄芩素和黄芩素是通过凋亡途径对MCF7细胞产生杀伤作用，而其他化合物则不是。丹叶大黄素、汉黄芩素和千层纸素A是通过凋亡途径对MCF7/ADR细胞产生杀伤作用，而其他化合物则不是。之后，为了研究同一个化合物对两株细胞杀伤作用的差异是否与P-gp作用相关，考察了大黄中丹叶大黄素、云杉鞣酚和大黄素，黄芩中汉黄芩素、黄芩苷、千层纸素A和黄芩素对P-gp酶活的作用，结果显示黄芩苷是P-gp酶活性的抑制剂，而其他6种成分是P-gp酶活性的激动剂。进一步研究黄芩苷和P-gp之间关系，采用流式细胞术和Western blot检测不同浓度的黄芩苷对MCF7/ADR细胞中P-gp表达量的影响，结果显示黄芩苷并没有显著影响P-gp表达。黄芩苷和DOX之间的协同作用，结果显示黄芩苷可以逆转MCF7/ADR细胞对阿霉素的耐药性。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

一、课题背景介绍

(一)乳腺癌及多药耐药现象

(二)中药抗乳腺癌研究现状

(三)细胞膜色谱法原理及方法学研究

(四)细胞膜色谱技术在筛选中药抗肿瘤活性成分中的应用

二、本课题研究内容及意义

第二章 高低表达P-gp的MCF7和MCF7／ADR全二维细胞膜色谱系统的构建

一、引言

二、试剂与仪器

(一)试剂和材料

(二)仪器

三、实验方法

(一)MCF7和MCF7／ADR细胞的培养

(二)MCF7和MCF7／ADR细胞中P-gp表达量检测

(三)经APTES修饰的全二维MCF7和MCF7／ADR细胞膜色谱系统的构建

四、结果与讨论

(一)MCF7和MCF7／ADR细胞P-gp的表达量

(二)MCF7和MCF7／ADR全二维细胞膜色谱系统的构建

五、本章小结

第三章 基于全二维乳腺癌细胞膜色谱法的中药抗乳腺癌活性成分筛选

一、引言

二、试剂与仪器

(一)试剂和材料

(二)仪器

三、实验方法

(一)中药提取液的制备与鉴定

(二)全二维MCF7和MCF7／ADR细胞膜色谱系统的搭建

四、结果与讨论

(一)中药样品的准备与鉴定

(二)全二维细胞膜色谱筛选实验结果

五、本章小结

第四章 中药抗乳腺癌潜在活性成分的药效验证及其与P-gp关系研究

一、引言

二、试剂与仪器

(一)试剂和材料

(二)仪器

三、实验方法

(一)细胞培养

(二)抗乳腺癌药效验证实验

(三)P-gp酶活实验

(四)黄芩苷对MCF7／ADR细胞中P-gp表达量的影响

(五)黄芩苷逆转MCF7／ADR细胞的多药耐药

四、结果与讨论

(一)潜在活性化合物对MCF7和MCF7／ADR细胞药效验证

(二)潜在活性化合物对两株乳腺癌细胞药效差异与P-gp之间关系

五、本章小结

全文总结

参考文献

综述

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢