肝细胞癌中的乙肝病毒基因整合规律及其促癌作用研究

摘要

研究背景:　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染导致的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是中国最重要的死亡原因之一。体细胞变异是HCC进化的基础，而HBV基因整合是HBV-HCC特有的突变类型，也是HBV直接损伤人体基因组的方式。大量研究发现HBV整合事件在HCC基因组中积累，提示这类突变可以赋予变异细胞生存优势，进而促进癌症发生。目前该领域的研究存在以下局限性:首先，关于HBV整合的研究都局限在基因组水平，缺乏转录组水平的研究。基因组水平的HBV整合突变影响基因转录的方式和程度尚不明确;前基因组RNA的合成与逆转录是HBV复制的关键步骤，目前不能确定在相关过程中病毒RNA是否可以直接整合到人体RNA链。其次，个体间的HBV突变谱差异较大，阻碍了HBV整合突变的有效检测和全面分析。第三，目前仅有TERT和MLL4基因被证实为常见的HBV整合基因，上述2种基因中的HBV整合突变仅占此类突变总量的2％以下;其余大量HBV整合突变的促癌功能尚待研究。最后，HBV整合的发生机制也不明确。载脂蛋白BmRNA编辑多肽3家族(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide3，APOBECE3)是诱导体细胞突变和病毒突变产生的重要分子，可以诱导人体和病毒核酸链断裂，但是尚无研究阐明APOBEC3对HBV整合的作用。HBV-HCC的发生发展是遗传、免疫和病毒因素共同作用的进化过程。研究APOBEC3的单核甘酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）在病毒突变和癌症发生中的作用对明确HBV致癌过程有重要意义。　　研究目的:　　明确HBV整合在基因组和转录组水平的分布规律;研究HBV整合的发生机制以及这类突变在肝细胞癌进化过程中的作用;阐明APOBEC3致突变基因与HBV整合的关系;分析APOBEC3遗传多态性与病毒清除、病毒突变和HCC风险的相关性;为HBV感染者的癌症防治提供新靶点。　　研究方法:　　应用50例HCC患者的癌和癌旁组织进行HBV-捕获测序以及RNA测序。以HBV各基因型的标准序列为基础，利用患者体内的HBV突变信息进行校正，生成每个患者个体化的病毒参考序列。将测序片段与人核基因组、线粒体基因组以及病毒基因组参考序列进行比对，确定HBV整合突变。随机挑选80个DNA和RNA水平的整合位点，以巢式PCR和Sanger测序的方法进行验证。分别利用标准化配对测序片段数(support PE-assembled reads，NNSS)和嵌合测序片段数(reads)评价DNA和RNA水平的整合突变信号强度。在DNA水平，NNSS≥1的HBV整合突变纳入分析;在RNA水平，reads≥2的HBV整合突变纳入分析。以x2检验分析HBV整合突变在人基因组、病毒基因组以及人群间的分布特征。为排除低频随机整合的影响，以HBV整合突变信号强度的上四分位点为界值，筛选高强度的整合突变，重复验证HBV整合突变分布规律。采用Wilcoxon非参数秩和检验分析HBV整合突变的数量差异;以t检验或方差分析评价基因表达水平的差异;以Pearson相关性检验分析APOBEC3表达与HBV整合突变的相关性;以Log-Rank检验评价HBV整合突变对HCC患者预后及复发的影响;以KEGG和GSEA分析确定HBV整合突变显著影响的信号通路和生物功能。P＜0.05则判定差异具有统计学意义。下载HCC人群的高通量测序和表达谱公共数据库，包括HBV捕获测序数据库（SRP068532，426例样本）、癌症基因组联盟(The Cancer Genome Atlas，TCGA)的HCC随访队列数据库(LIHC，366例)以及基因表达数据集(Gene Expression Omnibus，GEO)的HCC表达谱数据库（GSE14520，242例）。利用上述数据库对本研究发现的HBV整合突变规律及功能进行验证。挑选APOBEC3A、APOBEC3B、以及DNA修复基因UNG的4个SNP位点进行研究。使用荧光定量PCR的方法对1449例健康对照和3772例HBV感染者（包括1271例HCC患者）进行SNP分型，使用巢式PCR扩增病毒preS和BCP区片段，使用MEGA软件分析病毒突变。用logistic回归计算SNP基因型与病毒清除、病毒突变以及HCC风险的相关性。　　研究结果:　　1.DNA和RNA水平的HBV整合规律有显著差异　　以HBV突变信息校正参考序列，可以提高HBV整合事件的检出率。本研究在基因组和转录组水平分别检测到HBV整合突变2777个和2918个。在DNA水平，癌症组织中的HBV整合数量显著高于癌旁组织(P=1.0×10-4);HCC术后未复发人群→HCC术后晚期复发人群（大于2年）→HCC术后早期复发人群（小于等于2年）的癌症组织中，HBV整合突变数量逐渐升高。在RNA水平，癌症组织中的HBV整合数量显著少于癌旁组织(P=1.2×10-3);各HCC进化阶段的人群之间，HBV整合突变数量没有显著差别。DNA水平的HBV整合突变仅有0.5％分布在线粒体基因组，而RNA水平的HBV整合突变则有19.43％分布在线粒体基因组。这一差别在验证队列中得到重复。　　2、HBV X片段是整合入人体基因组的主要片段　　HBV X区(nt1374-nt1835)的整合事件数在DNA水平、RNA线粒体基因组水平以及RNA核基因组水平的比例分别为31.6％，35.1％，以及58.0％，显著高于随机整合率(14％)。在高信号强度的HBV整合突变中，HBV X片段的比例更高。　　3、HBV高频整合基因　　在DNA水平，292个基因在≥2个样本中均检测到HBV整合突变，定义为重复整合基因;其中仅有11个(3％)在RNA水平也被鉴定为重复整合基因;只有2个(MLL4和TERT，0.6％)可以在同一样本的DNA和RNA数据中发现高度一致的HBV整合突变。在DNA水平，TERT的HBV整合突变检出率最高(16％)，全部分布在启动子区。在RNA水平，ALB的HBV整合检出率最高(51％);同时，全部13个线粒体编码基因均发生了HBV整合突变，而且重复检出率均在13.2％-43％。　　4、HBV整合与基因表达的相关性　　在DNA水平，TERT启动子区的HBV整合与TERT基因在癌症组织中的表达升高有关(P=3.89×10-8);同时TERT上游3kb区域中HBV X片段的反向插入也有促进TERT表达的趋势;MLL4、MT-ND4等重复整合基因的表达水平与HBV在DNA链的整合无关。在RNA水平，MLL4、ALB、HP、MT-CO2和MT-CYB上的HBV整合突变与基因表达水平升高有显著相关性。　　5、HBV整合突变相关的信号通路　　DNA水平的整合突变显著富集于PI3K-mTOR通路和染色质重塑通路，通路整体整合突变率分别为30％和20％。RNA水平的整合突变显著富集于IL2-STAT5和IL6-STAT3等炎症通路。　　6、HBV整合对HCC预后的影响　　癌旁组织中DNA水平的HBV整合总数过高预示早期复发(P=0.012)，该作用在验证队列中得到重复(P=0.014)。RNA水平上，癌旁组织中核基因组以及线粒体基因组上的整合突变总数过高，均可以预示HCC患者整体生存预后不良(P=0.027，0.033)。　　研究结论:　　1、HBV整合突变的分布规律在DNA和RNA水平存在显著差异，绝大多数RNA水平的HBV整合突变不是由DNA的整合突变转录而来，而是在RNA链上直接插入病毒片段导致。　　2、RNA水平的HBV整合显著影响线粒体有氧氧化呼吸链的相关基因，DNA水平的HBV整合基因显著富集致癌通路;基因组和转录组水平的HBV整合事件数量过高均与预后不良有显著相关性，初步明确了HBV整合的促癌作用。　　3、发现RNA水平整合突变的发生与致突变基因APOBEC3A、APOBEC3B的表达呈正相关，同时也与体内炎症免疫通路密切相关;初步证明炎症通路刺激下诱变分子表达升高可以促进HBV整合突变的产生。　　4、APOBEC3A、APOBEC3B以及UNG的表达水平可以影响HCC患者预后，但APOBEC特征性的突变仅在非HBV感染导致的HCC患者中与预后相关;APOBEC3B和UNG的SNP位点(rs2267401和rs3890995)可以通过促进高危HBV突变产生，进而增加癌症风险;提示在HBV-HCC中，APOBEC3A、APOBEC3B和UNG不是通过直接损伤人体基因组致癌，而是通过与HBV相互作用导致癌症发生。

目录

声明

摘要

主要英文缩写词表

前言

第一部分 肝细胞癌中的乙肝病毒基因整合规律及其促癌作用研究

实验材料

研究方案

研究结果

一、研究对象基本特征及HBV整合突变检出率

二、HBV整合突变在DNA和RNA水平的分布规律有显著差异

三、发生HBV整合突变的主要病毒基因组片段和宿主基因

四、HBV整合突变的功能预测

五、病毒载量与炎症诱变分子对HBV整合的影响

分析与讨论

第二部分 APOBEC3和UNG遗传多态性与肝细胞癌发生风险的关联性研究

实验材料

研究方案

研究结果

一、研究对象基本特征SNP分型成功率

二、APOBEC3／UNG SNPs与HCC发生风险的相关性

三、APOBEC3／UNG SNPs与HBV慢性感染和HBV清除的相关性

四、HBV突变与HCC发生风险的相关性

五、APOBEC3／UNG SNP与HBV突变的相关性

六、HBV-HCC发展过程中APOBEC3／UNG SNP之间的交互作用，以及SNP与HBV突变的交互作用

分析与讨论

结论与意义

参考文献

综述

在读期间发表论文和科研工作情况

致谢