铂类配合物的抗肿瘤与抑制Aβ肽聚集的机理研究

摘要

自从顺铂(cisplatin)被批准作为抗肿瘤药物以来，新型铂药物的设计和药用机理一直备受关注，特别是在克服铂类药物毒副作用和耐药性方面的研究。虽然DNA是铂药物公认的作用靶点，但是药物从细胞摄入到细胞核是一个复杂的过程，这些过程包括药物的细胞摄取、药物胞内的分布、解毒蛋白的竞争反应以及排出细胞，最终仅有少量的药物与DNA结合。顺铂对各种DNA并没有选择性，因而蛋白质在铂类药物的毒副作用和细胞耐药性方面起着决定性的作用，铜蛋白是其中重要的一类蛋白，并且顺铂的许多细胞过程与铜的平衡紧密联系。另外，铂配合物除了作为抗癌药物外，最近发现邻菲罗琳铂配合物能够抑制Aβ蛋白的聚集并降低Aβ的毒性，被认为具有潜在治疗阿尔茨海默症的应用前景。
　　 本论文围绕铂配合物在抗肿瘤作用和抑制Aβ蛋白聚集两个方面，研究了铂配合物与生物分子（蛋白质和DNA）的相互作用。内容主要涉及三个方面：(1)研究了含硫生物分子（蛋氨酸、多肽和蛋白质）对单功能铂配合物与DNA反应的影响。发现含硫配体的结合可以使得单功能铂的配位构型在与DNA反应时转化为反式配位结构；(2)研究了铜离子转运蛋白(CTR1)第二个跨膜域(TM2)与顺铂和奥沙利铂的反应，并查看了二者在CTR1-N端区域和TM2之间的传递反应。发现CTR1转运顺铂和奥沙利铂的机理可能有所不同。同时也研究了CTR1从血清蛋白等摄取铜的反应；(3)研究了邻菲罗琳铂配合物抑制Aβ肽聚集的机理。PtCl2(phen)和Aβ作用主要以两种方式，非共价相互作用和配位作用。详细内容归纳如下：
　　 第一章主要是对铂类药物抗肿瘤机理的综述，包括铂药物的结构-活性关系，铂药物的摄取、运输、与靶点DNA的作用以及药物的毒副作用和抗药性。同时也综述了铜离子转运蛋白与铂药物的作用。
　　 第二章应用NMR、HPLC和ESI-MS等手段研究了单功能铂配合物cis-[Pt(NH3)2(py)Cl]Cl(cDPCP)在蛋氨酸、含硫多肽和蛋白质等含硫分子存在的情况下与DNA的相互作用。研究发现cDPCP与Met生成的主要产物为cis-[Pt(NH3)2(py)(Met)]Cl2和trans-[Pt(NH3)(py)(Met)Cl]Cl，二者可继续与DNA结合生成相同的三元复合物trans-[Pt(NH3)(py)(Met)(DNA)]，该三元复合物同时也是反式铂配合物trans-[PtCl2(NH3)(py)]与蛋氨酸和DNA反应的最终产物。说明在此过程中蛋氨酸调控单功能铂配合物转化为反式铂构型。类似的反应也在含硫多肽(CTR1-N8，H7)和蛋白质(Albumin，Histone1)上得到进一步验证。这说明单功能铂配合物在运输过程中很可能作为反式铂配合物的前体，二者在抗癌机理方面很可能有相似之处。
　　 第三章研究了抗癌药物顺铂和奥沙利铂(oxaliplatin)与CTR1N端八肽(N8)和第二个跨膜域(TM2)的反应。ESI-MS检测发现顺铂与TM2生成的主要产物为[Pt+TM2]Cl2，但也可以观测到[Pt(NH3)2+TM2]Cl2。奥沙利铂与TM2形成[Pt(DACH)+TM2]Cl2。在传递反应中，cDDP/N8的复合物[PtCl+N8]Cl能够继续与TM2反应生成[N8+Pt+TM2]Cl2和[Pt+TM2]Cl2，而oxaliplatin/N8的复合物[Pt(DACH)+N8]Cl2不与TM2反应。说明CTR1转运cDDP和oxaliplatin可能存在不同的机理。
　　 第四章主要应用质谱和电子顺磁共振等手段研究了Cu2+/Cu+与CTR1-N端区域(CTR11-16，CTR11-55)的反应。Cu2+多比例结合在CTR1-N端NH2-MDH和富含His的区域，其结合常数比HSA-Cu2+的低一个数量级。对于Cu+而言，铜与CTR1-N端也有较高的结合能力，其更倾向于结合富含Met的区域。另外，EPR数据显示CTR1N端可以从HSA-Cu2+和[Cu(His)2]2+复合物中夺取Cu2+，说明血液中的血清蛋白和组氨酸可能作为铜的转运因子。
　　 第五章研究了PtCl2(phen)抑制Aβ蛋白聚集的作用机理。邻菲罗琳(phen)配体与Aβ肽之间的非共价作用极大的促进了Pt与Aβ1-16的配位反应，并生成多个产物。应用HPLC和MS/MS分析了各产物的结合位点，其中His6/His14为主要的反应位点，Asp7，His13和Lys16也被证实为Pt的结合位点。主要的产物为单核铂加合物[Pt(phen)+Aβ1-16]。[Pt(phen)]与Aβ的螯合作用阻碍了Aβ自身的分子间相互作用，对抑制Aβ聚集产生重要的作用。
　　 由于铂配合物占据了Cu(Ⅱ)的结合位点，并且铂具有更强的结合能力，因此PtCl2(phen)可以从Cu2+-Aβ复合物中夺取铜。在此过程中，邻菲罗琳配体phen也从铂原子上脱离，导致最后铂化的产物为[Pt(DMSO)+Aβ1-16]和[2Pt(DMSO)+Aβ1-16]。这与PtCl2(phen)直接和Aβ1-16反应的产物完全不同，说明铜离子在邻菲罗琳配体释放的过程中起了重要作用。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1.1 癌症与铂类药物

1.1.1 引言

1.1.2 经典的铂类配合物与结构活性关系

1.1.3 非经典的铂类配合物

1.2 铂类药物的抗肿瘤机理

1.2.1 顺铂的摄取与泵出

1.2.2 铂药物在细胞内的运输

1.2.3 顺铂主要的作用靶点DNA

1.2.4 顺铂的多靶点及其耐药性和毒副作用

1.3 铜转运蛋白与铂类药物

1.3.1 铜离子的平衡

1.3.2 铜摄取蛋白(CTR1)

1.3.3 铜伴侣蛋白(Atox1)

1.3.4 铜泵出蛋白ATPases(ATP7A/7B)

1.4 铂类配合物在其它疾病中的应用

参考文献

第二章 含硫生物分子对单功能铂配合物的影响

2.1 引言

2.1.1 铂类药物的结构与活性关系

2.1.2 单功能铂配合物

2.1.3 铂类药物与蛋白质的作用

2.1.4 本课题的提出及待解决的问题

2.2 实验方法

2.2.1 试剂材料

2.2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 cDPCP与含硫生物分子模型物蛋氨酸的反应

2.3.2 tAPDP与含硫生物分子模型物蛋氨酸的反应

2.3.3 含硫生物分子对cDPCP与DNA反应的影响

2.3.4 单功能铂化合物与血清蛋白的反应

2.3.5 单功能铂化合物在跨膜过程中可能的转化

2.3.6 组蛋白H1对单功能铂化合物与DNA反应的影响

2.4 结论

参考文献

第三章 铂配合物与铜转运蛋白(CTR1)功能区域的作用

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂材料

3.2.2 多肽合成

3.2.3 实验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 CTR1 N端八肽(N8)与顺铂的反应

3.3.2 CTR1 N端八肽(N8)与奥沙利铂的反应

3.3.3 CTR1跨膜24肽(TM2)与顺铂的反应

3.3.4 CTR1跨膜24肽(TM2)与奥沙利铂的反应

3.3.5 N8/cDDP复合物与TM2的反应

3.3.6 N8/oxPt复合物不与TM2发生反应

3.3.7 N8/cDDP复合物与氨基酸的反应

3.3.8 N8/oxPt复合物与氨基酸的反应

3.3.9 铂配合物与CTR1多肽之间的非共价相互作用

3.4 小结

参考文献

第四章 铜离子转运蛋白(CTR1)摄取铜的机理研究

4.1 引言

4.1.1 哺乳类动物对铜的吸收和代谢

4.1.2 血清蛋白、铜蓝蛋白、组氨酸等作为铜的转运因子

4.1.3 铜转运蛋白(CTR1)转运铜从胞外到胞内

4.1.4 课题的提出

4.2 实验部分

4.2.1 试剂材料

4.2.2 GB1-CTR1-55蛋白表达

4.2.3 GB1-linker蛋白表达

4.2.4 实验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 hCTR1-N端区域与Cu2+/Cu+的作用

4.3.3 hCTR1-N端区域与HSA-Cu2+复合物的作用

4.3.4 hCTR1-N端区域与Cu(His)2的作用

4.4 小结

参考文献

第五章 邻菲罗琳铂配合物抑制Aβ蛋白聚集的机理研究

5.1 引言

5.1.1 β-淀粉样肽与老年痴呆症

5.1.2 金属离子促进Aβ蛋白的聚集

5.1.3 金属离子与Aβ蛋白的作用机理

5.1.4 铂类金属配合物对Aβ肽聚集的抑制

5.1.5 本课题的提出及待解决的问题

5.2 实验部分

5.2.1 试剂材料

5.2.2 实验方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 PtCl2(phen)在DMSO/H2O中的溶剂反应

5.2.3 PtCl2(phen)与Aβ1-16的作用

5.3.3 非共价相互作用促进PtCl2(phen)与Aβ肽的反应

5.3.4 PtCl2(phen)与Cu2+-Aβ1-16复合物的作用

5.3.5 配体决定铂配合物与Aβ肽的作用

5.3.6 讨论

5.4 结论

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果