云南宣威肺癌全基因组DNA甲基化

摘要

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率居我国恶性肿瘤首位。云南省宣威市及富源县肺癌发病率远高于其他地区，且女性发病率与男性接近，其肺癌发生与环境因子有关，宣威和富源地区肺癌高发已成为当地严重的社会健康问题。DNA甲基化修饰参与了多种生命活动。研究发现，DNA甲基化在肺癌发生过程中具有重要作用。本工作研究宜威肺癌全基因组DNA甲基化，以此探讨宣威肺癌的发病机理及环境因子与DNA甲基化的关系。
　　 本研究采用全基因组甲基化芯片(MeDIP-chip)分析5例宣威肺癌组织及癌旁组织DNA甲基化情况。芯片结果显示，在癌组织中发生高甲基化但在癌旁组织无甲基化的高甲基化基因共有3720个;在5例组织中高甲基化基因90个;在4例组织中高甲基化基因208个;在3例组织中高甲基化基因320个。甲基化芯片结果采用MoleculeAnnotationSystem(MAS)软件分析高甲基化基因的功能和参与的信号通路。这些高甲基化基因主要集中在Neuroactiveligand-receptorinteraction，Wntsignalpathway，Calciumsignalpathway等信号通路，其生理功能主要表现为生物发育、细胞黏附、细胞增殖、信号转导等。经文献复习分析，本次芯片检测发现一批新的与肺癌相关的DNA高甲基化基因。
　　 本研究根据芯片检测结果，选取了6个基因的7个位点(MEOX-2、LRFN5、GRM8、EN1promoter、EN1within、HOXD10及NID2)，利用甲基化特异性PCR(methylation-specificPCR，MSP)在43例宣威肺癌组织及癌旁组织对其甲基化状态进行验证。结果显示:MEOX-2、LRFN5、GRM8、EN1promoter、EN1within、HOXD10及NID2的DNA甲基化频率在宣威肺癌组织和对应的癌旁组织间存在显著性差异(P＜0.05)。基因甲基化与临床病理学特征相关性统计分析显示:7个基因位点在女性患者中甲基化检出率均高于男性，但没有显著性差异(P＞0.05);7个基因位点在年龄大于60岁和小于60岁患者中甲基化检出率无显著性差异(P＞0.05);NID2在肺腺癌和肺鳞癌患者中具有显著性差异(P＜0.05);7个基因位点在吸烟和不吸烟患者中无显著性差异(P＞0.05)。
　　 本研究还观察了去甲基化试剂5-Azacytidine处理人肺癌细胞株A549和EPLC-32M1后，其基因启动子区域甲基化状态，并采用q-RT-PCR检测了5-Azacytidine处理前后EN1和GRM8mRNA表达水平的变化。A549和EPLC-32M1细胞系经5-Azacytidine处理后，EN1和GRM8mRNA均表达上调，这提示DNA甲基化状态调控其基因表达。
　　 本研究结果表明，宣威肺癌组织中MEOX-2、LRFN5、GRM8、EN1promoter、EN1within、HOXD10及NID2基因的高甲基化可能与宣威肺癌的发生有关。本研究为探讨宣威肺癌的发病机理和寻找肺癌诊断标志物提供了重要资料。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 引言

1．2 云南宣威肺癌介绍

1．3 肺癌的发病原因及诊断

1．3．1 肺癌的发病原因

1．3．2 肺癌的诊断

1．4 肺癌发生与DNA甲基化

1．4．1 DNA甲基化的生理病理学意义

1．4．2 DNA甲基化与肺癌发生的关系

1．4．3 DNA甲基化作为诊断标志物研究进展

1．5 DNA甲基化的研究方法

1．5．1 单一基因甲基化分析方法

1．5．2 基因组水平DNA甲基化的改变研究

1．6 宣威肺癌全基因组甲基化研究目的及研究意义

第2章 全基因组甲基化芯片(MeDIP-chiP)分析肺癌差异甲基化位点

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．2．3 统计学方法

2．3 结果

2．3．1 肺癌组织病理学诊断及质量控制

2．3．2 肺癌组织DNA质量控制

2．3．3 Roche MimbleGen芯片杂交

2．3．4 MeDIP-chip芯片杂交后差异甲基化位点分析

2．3．5 结论

第3章 MEOX2、LRFN5、GRM8、EN1、HOXD10、NID2基因位点的甲基化分析

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．2．3 统计学方法

3．3 结果

3．3．1 肺癌组织及癌旁组织DNA高甲基化频率比较

3．3．2 基因甲基化状态与年龄相关关系

3．3．3 基因甲基化状态与性别相关关系

3．3．4 基因甲基化状态与肺癌组织类型相关关系

3．3．5 基因甲基化状态与吸烟相关关系

3．3．6 5-Azacytidine体外实验干预结果

3．3．7 结论

第4章 讨论

参考文献

附录

致谢