胎鼠卵巢体外培养及电转介导的外源基因在胎鼠卵巢的表达研究

摘要

卵巢是雌性哺乳动物重要的生殖器官和内分泌腺体，卵巢的功能由其基本结构单位卵泡实现，而卵泡的发育依赖于卵母细胞及颗粒细胞的相互作用。在小鼠中原始卵泡的形成起始于胚胎17.5天。为了大规模筛选哪些基因参与原始卵泡形成，我们建立了胎鼠及新生鼠卵巢体外培养的新方法，在此基础上利用电转有效实现了原始卵泡形成相关基因的功能验证，并且在原始卵泡无法形成的基因敲除鼠中恢复了原始卵泡的形成。
　　 首先我们构建并优化了一种简易的胎鼠及新生鼠卵巢体外琼脂糖培养体系，发现用该体系能模拟小鼠卵巢。利用该培养体系，以pcDNA3.0-H2B-GFP和FAM-non-targetingsiRNAs分别作为质粒和小RNA电转的marker转染培养的卵巢，组合不同电转参数，筛选出了胎鼠及新生鼠卵巢质粒和小RNA电转的最优电转参数，分别为27v，10ms，1000msinterval，10pulse和27v，10ms，1000msinterval，5pulse，正反一次电场。在此基础上验证了电转系统的安全性，证明电转并不影响卵泡的正常发育。随后对质粒和小RNA电转的效率进行了确认，发现卵巢中质粒电转效率可达到约32.80±2.91％，小RNA的电转效率可达到40％-54％。接下来对电转体系基因过表达及敲减的效果进行了表型验证。对胚胎18.5天的胎鼠卵巢体外培养并电转pcDNA3.1-GDF9-CyclinD1质粒，导致原始卵泡数目的显著下降，这与在CyclinD1过表达的转基因鼠中观察到的表型一致，说明电转体系可有效介导外源基因超表达。另一方面，通过电转PCNAsiRNAs对新生小鼠卵巢PCNA进行敲减，导致原始卵泡数目增多、原始卵泡启动发育受阻。最后，通过电转对FIGa基因敲除鼠进行了FIGa超表达，恢复了敲除鼠原始卵泡不能形成的表型。以上工作表明了胎鼠及新生鼠卵巢体外培养及电转的可行性。该研究首次尝试将电转应用于胎鼠及新生鼠卵巢发育相关基因过表达和敲减的研究，为探讨原始卵泡形成的基因调控提供了新方法。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 卵巢体外培养

1．2．1 卵巢体外培养简介

1．2．2 传统的卵巢体外培养

1．2．3 改良的卵巢体外培养

1．3 卵巢内直接注射(direct intraovarian injection，DII)

1．4 电穿孔

1．4．1 电穿孔的概念

1．4．2 电穿孔原理

1．4．3 电穿孔参数

1．4．4 DII与电穿孔

1．5 卵泡发育

1．5．1 PGCs(primordial germ cells)起源

1．5．2 PGCs的迁移

1．5．3 PGCs的增殖、凋亡及相关因子

1．5．4 卵包囊形成

1．5．5 卵包囊解体与原始卵泡的形成

1．6 Cyclin D1

1．6 1 Cyclin的概念

1．6 2 Cyclin D1的结构

1．6．3 Cyclin D1的功能

1．7 增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)

1．8 Figα(factors in the germline alpha)

1．9 研究意义

第二章 材料方法

2．1 实验动物

2．2 实验试剂及材料

2．2．1 质粒、小RNA和引物

2．2．2 卵巢培养基

2．2．3 试剂盒及相关试剂

2．3 实验仪器

2．3．1 显微注射针

2．3．2 显微注射仪

2．3．3 电转仪

2．4 实验方法

2．4．1 卵巢培养

2．4．2 基因组抽提及小鼠基因型鉴定

2．4．3 RNA抽提及RT-PCR

2．4．4 FIGα表达质粒构建

2．4．5 质粒提取

2．4．6 卵巢分离

2．4．7 DII

2．4．8 电转

2．4．9 胎鼠卵巢石蜡包埋，切片

2．4．10 免疫组织化学染色

2．4．11 石蜡切片Hoechst 33342染核

2．4．12 石蜡切片的HE染色

2．4．13 TUNEL染色

2．4．14 Western blot

2．5 统计分析

第三章 实验结果

3．1 卵巢体外培养系统的建立

3．1．1 不同培养模式

3．1．2 不同培养模式培养效果

3．2 电转体系的建立

3．2．1 质粒提取

3．2．2 电转电压筛选

3．2．3 脉冲时长筛选

3．2．4 脉冲次数筛选

3．2．5 最优电转参数

3．3 质粒电转效率确认

3．3．1 Western blot检测GFP表达

3．3．2 质粒电转效率统计

3．4 质粒持续表达时长检测

3．5 电转对卵巢损伤效应检测

3．5．1 电转对卵泡发育的影响

3．5．2 TUNEL染色检测卵母细胞凋亡

3．6 不同年龄卵巢小RNA电转参数筛选及效率验证

3．6．1 实验方案

3．6．2 不同年龄卵巢小RNA的电转

3．6．3 不同年龄卵巢小RNA电转效率验证

3．7 电转Cyclin D1对卵泡形成及发育的影响

3．7．1 实验方案

3．7．2 Western blot检测电转后Cyclin D1表达

3，7．3 组化检测电转后Cyclin D1定位及表达

3．7．4 Cyclin D1过表达对卵泡发育的影响

3．8 电转PCNA siRNAs对卵泡发育的影响

3．8．1 实验方案

3．8．2 Western blot检测PCNA knockdown

3．8．3 组化检测PCNA knockdown后卵泡发育

3．8．4 PCNA knockdown对卵泡发育的影响

3．9 电转FIGα恢复原始卵泡形成

3．9．1 构建FIGα表达质粒

3．9．2 电转pFIGα-EGFP-N1-FIGα

3．9．3 组化检测原始卵泡形成

第四章 实验讨论

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果