暗纹东方鲀中河豚毒素的蓄积、消除和分布规律研究

摘要

河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是一种非蛋白类神经毒素，能够选择性阻断钠离子通道抑制神经和肌肉传导，导致神经麻痹呼吸衰竭而死亡。其主要存在于河鲀鱼、织纹螺等海洋生物中。作为养殖河鲀的一个主要品种，暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）可通过食物链蓄积TTX。随着2016年中国政府允许有条件放开养殖暗纹东方鲀，近年来暗纹东方鲀养殖产业的快速发展，其养殖规模迅速增大，伴随而来的TTX风险水平也逐渐加大。　　因此，本文开展室内暴露实验，以无毒暗纹东方鲀为研究对象，投喂野生半褶织纹螺（Nassarius semiplicata）。模拟自然界食物链进行河豚毒素在暗纹东方鲀体内的蓄积和消除实验。为探究暗纹东方鲀中河豚毒素的风险形成机制提供方法依据，为科学预防河豚毒素中毒提供技术支持。具体研究内容与结果如下:　　1.本研究采用免疫亲和技术富集净化，选用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测，建立了一种能够检测河鲀鱼中各个组织河豚毒素含量的方法。方法在0.3～20ng/mL范围内成良好的线性关系。检出限和定量限分别为0.1μg/kg和0.3μg/kg，灵敏度高。检测时间仅用5min，快速准确。在空白肌肉、肝脏、皮肤和血液中分别加入0.3、2.0、5.0μg/kg(L)三个添加水平，平均回收率达到87.05％～95.64％，RSD均小于10％。该方法优化了各项参数条件后，绝对基质效应在96.05％～105.35％之间，有效降低了基质效应，可满足国内检测的要求。结果表明，该方法可为测定河鲀鱼各个组织中河豚毒素含量提供技术支持。　　2.本研究给无毒的暗纹东方鲀投喂有毒的织纹螺饵料，使其蓄积河豚毒素。采用超高效液相色谱-串联四极杆质谱法，鉴定出暗纹东方鲀中除TTX外还有7种TTX衍生物:5-deoxyTTX,11-deoxyTTX,4,9-anhydroTTX,6,11-dideoxyTTX,8,11-dideoxyTTX,5,6,11-trideoxyTTX和4,9-anhydro-5,6,11-trideoxyTTX。其中5/11-deoxyTTX是主要衍生物，其次是6/8,11-dideoxyTTX。TTX衍生物(TTXs)特异性的分布于不同组织中。皮肤中TTX衍生物种类最多，7种衍生物都能检测到，且含量最大。气囊、鱼鳃、肠、肝脏以及血液中未检测到4，9-anhydro-5，6，11-trideoxyTTX，其余均含有。胆、肾和肌肉中的TTX衍生物种类较少且含量较低。其中，胆含有5/11-deoxyTTX、4，9-anhydroTTX和5，6，11-trideoxyTTX;肾含有5/11-deoxyTTX、6/8，11-dideoxyTTX和4，9-anhydroTTX;肌肉只含有5/11-deoxyTTX和6/8,11-dideoxyTTX。　　3.本研究以暗纹东方鲀为实验对象，分析暗纹东方鲀各组织中TTX的蓄积消除含量变化、转化及分布规律如下:　　蓄积规律:3个暴露剂量组的河鲀体内TTX蓄积率为35.76％～40.20％。且在蓄积实验的28天内，低剂量所有组织中TTX含量从无毒增加至10.68～717.35ng/g，中剂量所有组织中TTX含量从无毒增加至20.51-1484.20ng/g，高剂量所有组织中TTX含量从无毒增加至99.37～6000ng/g。三个剂量的蓄积速率都在第1-7天较低，在0.17～39.20ng/g/d之间，在第7-21天最大，在0.86～338.085ng/g/d之间，第21-28天趋于平缓，在0.33～328.57ng/g/d之间。三个剂量的蓄积规律具有一致性，无显著差异(P＞0.05)。　　消除规律:在消除实验的39天内，随着消除时间的增加，组织中TTX含量整体呈现下降的趋势。在消除初期（第29-39天）下降最快。后期（第39-67天）下降趋势趋于缓慢。最小消除速率常数K在0.036～0.055d-1之间，TTX最长半衰期B1/2在12.58～19.04d之间。三个剂量组的消除规律无显著差异(P＞0.05)。　　转化规律:在整个实验阶段，当TTX量增加时，转化为TTXs的量也增多。在蓄积终点量最大，转换为无毒饲料切断TTX来源后，其衍生物的量也逐渐降低。在蓄积第1天即在所有组织中测到5/11-deoxyTTX，其他衍生物基本都在蓄积中后期能够检测到或只在高剂量组检测到。转化速率在第21-28天时最快。　　分布规律:各组织中TTX分布趋势为:皮肤＞肝＞血液＞肠＞气囊＞鳃＞肌肉＞肾＞胆。皮肤中TTX所占比例最大，在69.35％～73.00％之间。肝脏次之，在16.05％～19.16％之间。两者明显高于肠，肌肉，血液，气囊和鳃等组织。血液和肠所含TTX的比例基本一致，在2.03％～3.72％之间。胆和肾中基本不蓄积TTX。结果证明，在暗纹东方鲀幼苗阶段，肝脏和性腺等均未发育成熟时，通过食入有毒生物体蓄积的TTX主要聚集在皮肤和肝脏中，皮肤最高，肝脏次之。TTX在暗纹东方鲀各组织中的分布呈组织特异性。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1研究背景

1．1．1河鲀鱼的研究概况

1．1．2河豚毒素的结构及性质

1．1．3河豚毒素的衍生物

1．1．4河豚毒素及其衍生物在自然界的分布

1．2研究现状

1．2．1河豚毒素及其衍生物的分析方法

1．2．2河豚毒素衍生物的研究进展

1．2．3河鲀鱼中TTX累积机制的研究进展

1．3本课题的研究意义与研究内容

1．3．1研究意义

1．3．2研究内容

第二章超高效液相色谱-串联质谱法测定暗纹东方鲀各组织中TTX含量

2．1引言

2．2材料与方法

2．2．1主要材料与试剂

2．2．2主要仪器与设备

2．2．3配制溶液

2．2．4样品的提取与净化

2．2．5色谱条件

2．2．6质谱条件

2．3．1色谱条件的优化

2．3．2质谱条件的优化

2．3．3前处理条件的优化

2．3．4线性范围、检出限和定量限

2．3．5方法基质效应评价

2．3．6方法回收率和精密度

2．3．7实际样品验证

2．4小-结

第三章暗纹东方鲀摄入织纹螺后体内河豚毒素衍生物的鉴定

3．1引言

3．2．1仪器与设备

3．2．2材料与试剂

3．2．3饲养环境与饮食

3．2．4实验设计

3．2．5组织中TTX衍生物的提取

3．3．1暗纹东方鲀的饲养方法

3．3．2衍生物的鉴定

3．3．3半褶织纹螺与暗纹东方鲀中TTX衍生物的区别

3．3．4暗纹东方鲀各组织中衍生物的种类及含量

3．4小结

第四章暗纹东方鲀中河豚毒素的蓄积消除、转化和分布规律

4．1引言

4．2．1仪器与设备

4．2．2材料与试剂

4．2．3饲养环境与饮食

4．2．4实验设计与分组

4．2．5毒素的提取与测定

4．2．6消除动力学参数

4．3结果与讨论

4．3．1 TTX实际蓄积量

4．3．2 TTX的蓄积与消除

4．3．3 TTX的转化规律

4．3．4 TTX及其衍生物在暗纹东方纯中的分布

4．3．5河鲀鱼对TTX的耐受性

4．4小结

第五章结论与展望

5．1结论

5．2展望

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及研究成果