盐胁迫下滨柃(Eurya emarginata)幼苗的生理响应和转录组分析

摘要

本研究对滨柃(Eurya emarginata)进行不同程度盐胁迫处理，以氯化钠溶液为模拟盐溶液，设置三个浓度梯度，分别为0（对照组）、150（低浓度组）和300mmol/L（高浓度组）浓度，选取消毒后的健康种子，萌发后获得两个月大滨柃幼苗，胁迫培养35天之后观察各组滨柃生长状况，并采集根、茎、叶样品，测定它在不同盐胁迫条件下的含水率、各抗氧酶活性(Cu/Zn-SOD、CAT、POD、GPx)、叶绿素、光合参数（净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间CO2浓度）和脯氨酸及其相关酶活性(P5CS酶、脯氨酸脱氢酶)等生理数据的变化，并取叶子和根样品进行转录组测序分析，旨在探讨滨柃盐耐受的反应机理。研究结果如下:　　在低盐胁迫(150mmol/L)时，和对照组对比发现Cu/Zn-SOD、CAT、POD和PDH（脯氨酸脱氢酶）活性略有下降，P5CS酶活性、H+-ATPas活性上升，光合参数略有下降，净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和无显著性差异(P＞0.05)，叶绿素含量下降，各组织含水率下降，GPx基本不受影响，脯氨酸也没有明显的积累，滨柃叶和根中的离子含量发生变化，Na+累积量增加，同时K+含量下降，钠钾比例降低，但滨柃生长状况良好，说明各项生理数据的变化均在滨柃自身耐受能力内。在高盐胁迫(300mmol/L)时，和对照组对比发现，滨柃呼吸代谢总呼吸速率加快，光合效应受盐胁迫抑制，光合参数显著下降，净光合速率、蒸腾速率、气孔导度有显著差异(P＜0.05);叶绿素含量显著下降，叶绿素a比对照组平均减少50.14％，叶绿素b比对照组平均减少65.27％(P＜0.05)。植物体内水分含量降低，严重的限制了Cu/Zn-SOD、CAT和PDH（脯氨酸脱氢酶）、POD、GPx、P5CS酶、H+-ATPas的活性，脯氨酸和丙二醛大量积累，破坏了滨柃体内活性氧化物的代谢，其体内自由基被大量清除等，加重了细胞膜脂的过氧化程度，代谢产物丙二醛变多，电解质渗透率增强，细胞膜受到极大损害。滨柃叶和根中的离子含量发生变化，Na+累积量增加，对细胞的产生毒害作用，同时K+含量下降，钠钾比例降低，打乱了滨柃体内的离子动态平衡。　　通过滨柃的转录组测序，发现翻译、核糖体结构和生物转化(Translation，ribosomalstructure and biogenesis);一般性功能预测(General function prediction only);蛋白质转译后修饰，蛋白质转换和伴侣蛋白(Posttranslational modification，protein turnover，chaperones);能量的产生和转换(Energy production and conversion)等功能类别中差异表达基因富集显著，光合作用通路(Photosynthesis pathways)，光合作用天线蛋白通路(photosynthesis-antenna proteins pathways)和核糖体核糖体通路(Ribosomepathways)中的差异基因富集显著[FDR＜0.01且FC（Fold Change）≥2]。对测序所得数据进行分析，在滨柃经过300mmol/L氯化钠盐胁迫35天之后，参与Cu/Zn-SOD、CAT、GPx、P5CS、H+-ATPase和PDH等酶合成的反应过程涉及的基因多数表达下调[FDR＜0.01且FC(Fold Change)≥2]，即受到了抑制;在滨柃经过150mmol/L氯化钠盐胁迫35天之后，控制Cu/Zn-SOD和PDH合成对应基因也表现为下调，但富集程度较低，而控制CAT，GPx，H+-ATPase对应基因上调表达，P5CS基因则表达基本不受影响。这说明在分子层面上，滨柃有着与生理层面相对应的调控机制，在低盐胁迫的时候能够抵抗盐害带来的影响，有较强的耐盐性。在高盐害胁迫时，P5CS基因表达上调，说明其在对抗外界盐害时有极其重要的作用，而Cu/Zn-SOD、CAT、GPx、P5CS、 H+-ATPase基因表达下调，说明滨柃在300mmol/L浓度氯化钠胁迫时，相关耐盐基因表达受到抑制，滨柃生长代谢受阻，影响其正常生长。通过滨柃的转录组测序，得到大量的转录本序列和Unigene序列，组装后形成滨柃的Unigene库。将得到基因组序列进行比对，获得差异表达基因，数据显示在盐胁迫下滨柃的差异基因表达既有上调又有下调，其中以下调表达为主。根据Unigene库序列进行GO注释、COG注释和KEGG注释，分别得到各Unigene的相应功能及代谢途径，其中，为今后在基因组学和分子生物学的研究奠定基础。　　滨柃耐盐性较强，在150mmol/L的盐胁迫环境下能够正常健康的生长，可以作为海岛环境修复的耐盐优势树种。

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摘要

第一章 研究背景及文献综述

1．1 盐胁迫对植物生理影响的研究

1．1．1 盐胁迫对植物叶片水分的影响

1．1．2 盐胁迫对植物光合作用的影响

1．1．3 盐胁迫对植物抗氧化酶系统的影响

1．1．4 盐胁迫对呼吸作用的影响

1．1．5 盐胁迫对植物体内脯氨酸的影响

1．2 滨柃抗盐性研究进展

1．2．1 滨柃简介

1．2．2 滨柃抗盐性研究

1．3．1 转录组定义

1．3．2 第二代测序技术

1．3．3 转录组测序

1．4 本研究的目的和意义

第二章 滨柃幼苗在盐胁迫下的生理响应

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 含水量测定

2．2．2 抗氧化酶活性测定

2．2．3 丙二醛的测定

2．2．4 叶绿素的测定

2．2．5 、光合参数的测定

2．2．6 钠钾离子的测定

2．2．7 游离脯氨酸测定方法

2．2．8 P5CS酶活性测定方法

2．2．9 脯氨酸脱氢酶活性测定方法

2．3 数据处理及综合处理方法

2．4．1 盐胁迫下滨柃各组织中水含量的变化

2．4．2 盐胁迫下植物叶片中的钠钾含量和叶片含水率变化

2．4．4 NaCl胁迫对抗氧化酶的影响

2．4．5 盐胁迫对滨柃叶片中P50S、PDH和H+-ATPase活性的影响

2．4．6 盐胁迫对滨柃叶片中的丙二醛和游离脯氨酸的影响

2．4．7 盐胁迫对滨柃光合参数的影响

2．5 小结

第三章 盐胁迫下滨柃的转录组分析

3．1 实验材料

3．2 实验流程

3．3 实验仪器

3．4 实验方法

3．4．1 总RNA提取

3．4．2 RNA的纯化

3．4．3 样品检测和文库构建

3．3．4 生物信息学分析

3．5 结果

3．5．1 测序数据和组装结果

3．5．2 转录组测序文库质量评估

3．5．3 SSR和SNP分析

3．5．4 Un i gene功能注释

3．5．5 基因表达量分析

3．5．6 差异表达分析

3．6 讨论

第四章 结论和展望

4．1 结论

4．2 展望

附录

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及研究成果