日本对虾类甲壳肽(crustin-like)基因在溶藻弧菌和白斑综合征病毒感染过程中的作用机制研究

摘要

抗菌肽是在甲壳动物先天性免疫中发挥重要作用的几类小分子肽的总称，其中crustin是很重要的一类抗菌肽。本研究中，我们旨在研究日本对虾（MarsupenaeusJaponicus）在感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)或溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）时，类甲壳肽(crustin-like)基因所发挥的免疫功能。通过cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)，从日本对虾体内克隆到一条全长为660 bp的cDNA序列，软件推测分析显示该基因的开放阅读框大小为507bp，编码一个含有168个氨基酸残基的蛋白，基因3'末端含有一条Poly(A)尾巴，5'和3'的非编码区分别为72 bp和81 bp，推测出蛋白质的相对分子质量为16.22 kDa，pI为8.37。氨基酸序列比对和进化树分析显示crustin-like基因主要存在于甲壳动物中的对虾及少部分螃蟹中，其中在日本对虾发现的crutstin-like与凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)亲缘关系较近。　　通过实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测基因表达的组织特异性发现crustin-like在鳃内表达量最高，在血淋巴、肝胰腺、肌肉和消化腺内表达量较低。通过double-strand RNA(dsRNA)干扰技术，体外构建dsRNA表达载体，将纯化后的dsRNA注射到对虾体内，成功地抑制了crustin-like基因的表达。对已知重要的免疫相关基因的检测结果显示，在crustin-like被沉默后，对虾先天性免疫系统中多个免疫相关基因的表达受到影响，其中Immune deficiency homolog(IMD)、Rab7、L-lectin、mitogen-activated protein kinase(MAPK)、p53、prophenoloxidase(proPO)和Rho基因的表达显著下调，而nitric oxide synthase(NOS)、myosin及Tumor necrosisfactor-α（TNF-α）基因的表达显著上调。对虾免疫活性试验显示，在抑制crustin-like基因的表达后，对虾血细胞总数显著减少，酚氧化酶(PO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著减低。以上结果说明crustin-like对细胞吞噬作用、凋亡和部分免疫通路有显著的影响。　　进一步研究发现，在感染溶藻弧菌后，crustin-like基因的表达显著上调。统计死亡率发现，沉默crustin-like基因的表达后，对虾感染弧菌后累计死亡率显著增加。结果说明对虾crustin-like有明显的抗弧菌的作用。血细胞吞噬试验结果显示，对虾crustin-like基因被沉默后，对虾血细胞对溶藻弧菌的吞噬率显著升高，血淋巴细胞凋亡率显著升高，结果说明溶藻弧菌在感染对虾时可能会利用crustin-like来逃避对虾血细胞对弧菌的吞噬作用，这一现象还有待进一步的研究。　　在感染WSSV后12-72 h，crustin-like基因的表达显著升高。WSSV拷贝数检测和Kaplan-Meier生存分析结果显示crustin-like基因被沉默后，WSSV拷贝数显著降低，对虾存活率显著升高。抑制crustin-like基因的表达后，对虾血细胞对WSSV的吞噬率显著降低，对虾血细胞的凋亡显著升高。以上结果说明对虾crustin-like可以抑制细胞凋亡，而WSSV有可能利用crustin-like抑制细胞凋亡的功能来促进病毒粒子在对虾体内的复制。本文首次揭示了类甲壳肽在对虾病毒感染中有着重要作用，为研究对虾的先天性免疫和WSSV感染宿主的机制提供了重要的理论依据。

目录

声明

摘要

前言

1 日本对虾crustin-like基因全长序列的克隆

1．1 试验材料与仪器

1．1．1 试验动物与毒种

1．1．2 试验试剂

1．1．3 试验仪器与设备

1．2 试验方法

1．2．1 样品采集

1．2．2 血淋巴总RNA提取

1．2．3 cDNA末端快速扩增(RACE)

1．2．4 PCR扩增全长

1．2．5 克隆与测序

1．3 试验结果

1．3．1 全长序列拼接与分析

1．3．2 保守性分析

1．3．3 进化树构建

1．4 讨论

1．5 小结

2 日本对虾crustin-like基因敲低及免疫功能探究

2．1 试验材料与仪器

2．1．1 试验动物与毒种

2．1．2 试验试剂

2．1．3 试验仪器与设备

2．2 试验方法

2．2．1 组织表达量检测

2．2．2 dsRNA质粒构建

2．2．3 CRU-dsRNA的诱导表达

2．2．4 CRU-dsRNA干扰效果检测

2．2．5 免疫基因检测

2．2．6 免疫活性检测

2．2．7 数据统计

2．3 试验结果

2．3．2 dsRNA体外试验干扰crustin-like表达

2．3．3 重要免疫基因表达量检测

2．3．4 免疫活性检测

2．4 讨论

2．5 小结

3 日本对虾crustin-like基因抗菌活性的探究

3．1 试验材料与仪器

3．1．1 试验动物与毒种

3．1．2 试验试剂

3．1．3 试验仪器与设备

3．2 试验方法

3．2．1 病原诱导表达变化分析

3．2．2 Kaplan-Meier生存分析试验

3．2．3 吞噬试验

3．2．4 THC检测

3．2．5 血细胞凋亡

3．2．6 数据统计

3．3 试验结果

3．3．1 痼原诱导crustin-like表达变化分析

3．3．2 Kaplan-Meier生存分析试验

3．3．3 Crustin-like对细胞吞噬作用的影响

3．3．4 THC检测

3．3．5 Crustin-like对细胞凋亡的影响

3．4 讨论

3．5 小结

4 日本对虾crustin-like基因促进病毒复制的研究

4．1 试验材料与仪器

4．1．1 试验动物与毒种

4．1．2 试验试剂

4．1．3 试验仪器与设备

4．2 试验方法

4．2．2 WSSV提取与纯化

4．2．3 病毒拷贝数检测

4．2．4 THC检测

4．2．5 Kaplan-Meier生存分析试验

4．2．6 细胞吞噬试验

4．2．7 血细胞凋亡

4．2．8 WSSV早期基因检测

4．2．9 数据统计

4．3 试验结果

4．3．1 病原诱导表达变化分析

4．3．2 THC检测

4．3．3 WSSV提取

4．3．4 WSSV拷贝数检测

4．3．5 Kaplan-Meier生存分析试验

4．3．6 Crustin-like对细胞吞噬作用的影响

4．3．7 Crustin-like对细胞凋亡的影响

4．3．8 WSSV早期基因的检测

4．4 讨论

4．5 小结

5．全文总结

参考文献

附录

个人简介

致谢