乳酸杆菌对LPS诱导小鼠肠道过度自噬的保护作用及机制研究

摘要

乳酸菌作为应用最广泛的益生菌，在肠道稳态调控中发挥重要作用。仔猪肠道应激多发，乳酸杆菌等益生菌对肠道上皮稳恒调节作用尤为重要。阐明乳酸杆菌对肠道上皮细胞自噬具有什么样的调控作用，解析其发挥自噬调节作用的信号转导机制，将为益生菌调控肠道稳恒提供理论依据，对开发高效乳酸杆菌等益生菌、促进仔猪肠道健康具有重要意义。本试验旨在以公认的标准益生菌乳酸杆菌——鼠李糖乳酸杆菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）为标准菌株，分析不同黏附力以及不同剂量乳酸杆菌对LPS诱导肠道上皮细胞自噬的调节作用。　　构建体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7的LPS自噬模型，分析LGG预处理（2×107CFU/mL）对来源于大肠杆菌的脂多糖刺激诱导RAW264.7（1×106）细胞过度自噬的保护作用。采用脂多糖（LPS）腹腔注射C57BL/6小鼠，构建肠道过度自噬小鼠模型，通过构建的C57BL/6小鼠LPS致敏模型，分别连续灌胃106CFU/mL或109CFU/mL鼠李糖乳酸杆菌LGG一周，腹腔注射LPS诱发小鼠自噬，评价不同剂量鼠李糖乳酸杆菌对自噬的调节作用。以构建C57BL/6小鼠LPS致敏模型，连续灌胃108CFU/mL不同黏附力乳酸杆菌（LGG、ZJ617和ZJ615）一周后，腹腔注射LPS诱发小鼠自噬，评价不同黏附力乳酸杆菌对自噬的调节作用。小鼠试验结束时，处死小鼠后，采取小鼠血清，经过ELISA试验检测小鼠血清中氧化指标以及炎性因子，采用qRT-PCR技术检测小鼠肠道自噬基因mRNA的表达水平，采用Western-blot技术、免疫组化技术检测自噬相关基因以及紧密连接蛋白的表达水平。　　研究结果表明：1）与单纯LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞相比，LGG预处理RAW264.7细胞能够显著降低LPS诱导细胞产生的自噬作用（P＜0.05）。2）高、低不同剂量乳酸杆菌均能够降低LPS诱导小鼠肠道的自噬作用，高、低不同剂量乳酸杆菌能够显著降低LC3的表达量。小鼠血清指标分析显示，高、低不同剂量乳酸杆菌对LPS诱导小鼠炎症具有不同的调节作用，低剂量鼠李糖乳酸杆菌LGG对LPS诱导小鼠炎症无显著性调节作用，而高剂量鼠李糖乳酸杆菌LGG能够调节LPS诱导小鼠的炎症作用。有趣的是，在本试验研究中发现，LPS能够减少p-p38的表达量，高、低不同剂量乳酸杆菌能够减少p-ERK1/2的表达量，高剂量乳酸杆菌LGG能够抑制NF-κB信号通路的激活，以上结果表明，高、低不同剂量乳酸杆菌能够调节LPS诱导小鼠肠道炎症作用。试验同时发现高、低不同剂量乳酸杆菌能够增强紧密连接蛋白claudin3的表达。3）与单纯LPS致敏小鼠组相比，不同黏附力乳酸杆菌能够降低LPS诱导小鼠自噬作用。定量PCR分析显示不同黏附力乳酸杆菌处理组的小鼠肠段与单独LPS致敏组相比，显著降低LC3、Beclin-1基因mRNA的表达。Western-Blot结果表明与单独LPS致敏组相比，不同黏附力乳酸杆菌处理小鼠能够显著降低LC3蛋白和p-mTOR蛋白水平，LPS致敏小鼠能够增加凋亡蛋白Caspase-3的表达。高粘附力乳酸杆菌ZJ617处理的小鼠显著降低Caspase-3的表达量，不同黏附力乳酸杆菌均能够增强小鼠肠道紧密连接蛋白occludin的表达。　　由此可见，鼠李糖乳酸杆菌LGG能够对LPS诱导自噬发挥调节作用。高低不同剂量乳酸杆菌能够调节LPS诱导小鼠肠道的自噬作用，两种不同剂量乳酸杆菌对自噬调节作用无显著性差异。饲喂低剂量鼠李糖乳酸杆菌，对LPS诱导小鼠肠道炎症调节作用不明显，高剂量鼠李糖乳酸杆菌能够调节LPS诱导小鼠肠道炎症作用。不同黏附力菌株均具有调节LPS诱导小鼠肠道自噬的作用，均能够增强小鼠肠道紧密连接蛋白occludin的表达。

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第一章 文献综述

1 背景介绍

2 自噬的作用

3 自噬信号的调控

4 自噬与炎症

5 乳酸菌参与自噬保护作用

6 自噬模型

7 本研究的目的、意义和研究内容

第二章 不同剂量鼠李糖乳酸杆菌LGG对LPS诱导肠道自噬的调节作用

1 材料与方法

2 结果与分析

3.讨论

4 小结

第三章 不同黏附力乳酸杆菌对LPS诱导小鼠肠道自噬的调节作用

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第四章 总结、创新点和后续研究展望

1 总结

2 创新点

3 研究展望

参考文献

缩略词表

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致谢