单核细胞增多性李斯特菌溶血素LLO的功能关键位点鉴定及表面展示系统的构建

摘要

单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM），简称单增李斯特菌，是一种革兰氏阳性、食源性胞内病原菌。LM主要通过分选酶（Sortase）系统将含有LPXTG基序的蛋白锚定至胞壁并发挥相应功能。溶血素Listeriolysin O（LLO）是属于依赖于胆固醇的膜穿孔蛋白家族（CDCs），在游离状态下可以形成直径35 nm的孔状结构，插入到宿主细胞膜内，在李斯特菌逃离到细胞质中扮演着重要的角色。　　本研究分别以单增李斯特菌参考菌株EGD-e和弱毒株M7溶血素蛋白（Listeriolysin O，LLO）为研究对象，通过同源重组及氨基酸突变技术将编码LLO蛋白的基因hly在基因组水平上进行如下修饰：（1）构建LLO缺失突变株（ΔLLO）；（2）将野生株LLO蛋白第472-483位氨基酸缺失，使其形成携带LPXTG基序的重组LLO菌株（LLOLPXTG）。Western blot试验结果显示EGD-e和M7菌株缺失LLO后均未检测到LLO蛋白的表达，而LLOLPXTG缺失株检测到重组LLO蛋白的表达，证实ΔLLO缺失株和LLOLPXTG缺失株均构建成功；鼠源巨噬细胞RAW264.7胞内增殖试验表明，EGD-e的ΔLLO缺失株和LLOLPXTG缺失株的胞内增殖力显著减弱；溶血试验表明，M7的ΔLLO缺失株和LLOLPXTG缺失株的溶血活性完全丧失。体外原核表达纯化LLO及其第472-483位氨基酸突变体蛋白，并研究其体外溶血活性。结果显示只有LLO第478和479位氨基酸影响LLO的溶血活性。体内外试验表明单增李斯特菌LLO蛋白与细菌感染宿主细胞后的增殖能力密切相关。本研究首次发现并证实LLO第472-483位氨基酸为其关键位点，决定了LLO的活性及功能。LLO缺失株的构建可以为细菌体内表面展示技术在宿主细胞内进行抗原展示和递呈的研究奠定重要基础。　　综上所述，本研究首次发现并证实单增李斯特菌LLO第472-483位氨基酸为其关键位点或功能域，决定了LLO的活性及功能；单增李斯特菌LLOLPXTG表面展示重组菌株为将来胞内菌的抗原展示技术开发提供了一种工具，可以用于病毒病的预防和治疗。

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第一章 文献综述

1.1 李斯特菌概述

1.2 单增李斯特菌胞内感染过程

1.3 单增李斯特菌的毒力因子

1.4 溶血素LLO的研究进展

第二章 单增李斯特菌溶血素LLO蛋白的原核表达、纯化及抗体制备

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 试验结果

2.4 讨论

第三章 单增李斯特菌EGD-e表面展示系统的构建

3.1 单增李斯特菌基因敲除的原理

3.2 试验材料

3.3 试验方法

3.4 试验结果

3.5 讨论

第四章 单增李斯特菌M7表面展示系统的构建

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.3 试验结果

4.4 讨论

第五章 单增李斯特菌LLO关键氨基酸突变体的构建及溶血活性测定

5.1 试验材料

5.2 试验方法

5.3 试验结果

5.4 讨论

参考文献

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