TLR4受体信号传导通路参与人肝癌细胞株HepG-2分泌细胞因子机制的研究

摘要

本文首先研究肝癌细胞株HepG-2表面TLR4表达的情况，然后研究LPS刺激前后细胞因子分泌的改变情况，探讨TLR4的信号传导活化途径，最后研究TLR4内源性配体HSP70的作用途径。 研究方法： 1．分别利用RT-RCR和Western-blot方法检测肝癌细胞株HepG-2细胞TL-R4mRNA和TLR4蛋白的表达情况。 2．利用免疫组化的方法观察TLR4受体在肝癌组织中的表达情况。 3．利用R17-PCR和Western-blot方法分别检测和对比LPS刺激前后肝癌细胞株HepG-2中TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白的表达情况。然后检测阻断TLR4受体后LPS刺激肝癌细胞株HepG-2后TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白的表达情况。 4．利用RT-PCR和Western-blot方法分别检和对比LPS刺激前后肝癌细胞株HepG-2中NF-kB mRNA和蛋白的表达情况。然后检测阻断TLR4受体后LPS刺激肝癌细胞株HepG-2后NF-kB mRNA和蛋白的表达情况。 5．HSP70-肿瘤肽复合物的纯化：肝癌组织应用裂解液进行匀浆，并高速离心制备总蛋白。上述的总蛋白依次进行ConA-Sepharose亲和层析和DEAE-Sephacel离子交换层析分离纯化。所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westem blot进行蛋白分子量及性质鉴定，Bradford法测定蛋白浓度。 6．利用RT-PCR和Westem-blot方法分别检测和对比HSP70-肿瘤肽复合物刺激前后肝癌细胞株HepG-2中TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白的表达情况。然后检测阻断TLR4受体后HSP70-肿瘤肽复合物刺激肝癌细胞株HepG-2后TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白的表达情况。 7．利用RT-PCR和Western-blot方法分别检测和对比HSP70-肿瘤肽复合物刺激前后肝癌细胞株HepG-2中NF-kB mRNA和蛋白的表达情况。然后检测阻断TLR4受体后HSP70-肿瘤肽复合物刺激肝癌细胞株HepG-2后NF-kB mRNA和蛋白的表达情况。 研究结果： 1．利用RT-PCR可以检测到肝癌细胞株HepG-2有TLR4 mRNA的表达；利用Western-blot可以检测到肝癌细胞株HepG-2有TLR4蛋白的表达。 2．利用免疫组化表明肝癌组织中有TLR4的表达，其表达于细胞的细胞膜上，细胞浆中也可以有少量的表达，其阳性率约为76.7％(23/30)。 3．LPS刺激肝癌细胞株HepG-2后TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白的表达均增加，而阻断TLR4受体后TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白又下降。 4．LPS刺激肝癌细胞株HepG-2后NF-kB mRNA和蛋白的表达均增加，而阻断TLR4受体后NF-kB mRNA和蛋白又下降。 5．分离、纯化得到的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯量蓝鉴定为单一带，分子量为70kD；Western blot结果证实为HSP70。每10g组织最终获得8mg的HSP70。 6．HSP70肿瘤肽复合物刺激肝癌细胞株HepG-2后TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白的表达均增加，而阻断TLR4受体后TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白又下降。 7．HSP70肿瘤肽复合物刺激肝癌细胞株HepG-2后NF-kB mRNA和蛋白的表达均增加，而阻断TLR4受体后NF-kB mRNA和蛋白又下降。 研究结论： 1．肝细胞癌细胞株表面及人肝癌组织有TLR4的表达。 2．作为TLR4的外源性配体，LPS可以活化细胞内的NF-kB信号传导系统及促进细胞因子TGF-β1，VEGF，IL-6的表达。 3．使用ConA亲和层析和阴离子交换蛋白亲和层析二步蛋白纯化法可获得高纯度HSP70肽复合物。 4．作为TLR4的内源性配体，HSP70同样可以活化细胞内的NF-kB信号传导系统及促进细胞因子TGF-β1，VEGF,IL-6的表达。

目录

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英文缩略语

前言

论文一TLR4受体在肝癌细胞株HepG-2的表达

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二TLR4外源性配体LPS对肝癌细胞株HepG-2细胞因子表达的影响及其作用机制

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文三TLR4内源性配体HSP70对肝癌细胞株HepG-2细胞因子表达的影响及其作用机制

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

总结论

本研究的创新性的自我评价

参考文献

综述热休克蛋白70(HSP70)与肿瘤的关系

在学期间的科研成绩

致谢

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