自分泌神经营养因子Artemin以及催乳素调控肿瘤药物抗性的研究

摘要

在恶性肿瘤的治疗过程中，外科手术仍然是首选的治疗手段，往往配合以放射治疗、化学治疗以及分子靶向药物治疗，然而治疗过程中的原发性和获得性的药物抗性是亟待解决的问题。本论文中，我们研究了神经营养因子Artemin促进乳腺癌对于赫赛汀的药物抗性以及催乳素促进子宫内膜癌对于化疗药物阿霉素和紫杉醇的药物抗性。
　　先前已有报道，Artemin在乳腺癌中是一个促进肿瘤干细胞行为和肿瘤细胞转移的重要分子。在这部分工作中，我们发现了Artemin能够介导HER2阳性乳腺癌细胞对于分子靶向药物赫赛汀的获得性耐药性。在HER2阳性乳腺癌细胞中，能够激活HER2活性的配体同时能够增加Artemin的表达，相反的，赫赛汀抑制Artemin的表达。对于HER2阳性乳腺癌细胞，过表达Artemin能够分别在体外细胞实验中以及小鼠体内实验中降低细胞对于赫赛汀的敏感性。在反向实验中，siRNA介导的Artemin敲除能够增加赫赛汀的效力。在我们建立的赫赛汀耐药性细胞株中，Artemin的表达相对于野生型细胞有明显的上升，当Artemin被敲除以后能够恢复抗性细胞对赫赛汀的敏感性。赫赛汀耐药性细胞株检测出本身的肿瘤干细胞群体比例上升，同时球囊生长也有很大程度的增加，同时我们检测出BCL-2在耐药细胞株中高表达。当BCL-2被敲除以后，Artemin所介导的肿瘤干细胞比例上升就消除了。因此，在HER2阳性乳腺癌细胞中，Artemin是一个重要的介导因子，对于获得性赫赛汀耐药性具有重要的作用。
　　我们通过在人的子宫内膜癌细胞(EC)中过量表达催乳素(hPRL)建立了自分泌催乳素的子宫内膜癌细胞模型。催乳素能够显著提高子宫内膜癌细胞的增殖和细胞活力。相应的，过表达催乳素也能显著增加子宫内膜癌细胞的非锚定依赖性生长、转移和侵袭。在小鼠体内肿瘤模型中，催乳素增加了肿瘤大小，产生的肿瘤增殖能力强、分化程度较低，并且更具有局部浸润能力和促进远端转移灶的发生。与此同时，在体外细胞实验以及小鼠体内实验中，过表达催乳素都表现出降低了子宫内膜癌细胞对于化疗药物阿霉素和紫杉醇的敏感性。在这里，CD24发挥着重要作用，它位于催乳素下游能够被催乳素调节。CD24的敲除能够消除催乳素所引起的阿霉素和紫杉醇的药物耐受。小的干扰RNA(siRNA)所介导的催乳素敲低，显著降低了子宫内膜癌细胞的肿瘤恶性程度和侵袭能力并增加了其对化疗药物的敏感程度。因此，在子宫内膜癌中，基于抑制催乳素的药物开发可以被用来作为可行的治疗手段并可以作为治疗佐剂结合化疗药物使用从而提高化疗药物的疗效。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 肿瘤的基本概念

1．1．1 什么是肿瘤

1．1．2 良性肿瘤和恶性肿瘤

1．2 肿瘤的概况和种类

1．3 肿瘤的致癌因素和发病机制

1．4 肿瘤的治疗和预防

1．4．1 肿瘤的治疗

1．4．2 肿瘤的预防

1．5 乳腺癌

1．5．1 乳腺癌概况

1．5．2 乳腺癌的治疗

1．6 子宫内膜癌

1．6．1 子宫内膜癌概况

1．6．2 子宫内膜癌的治疗

第二章 Artemin受HER2调节，通过促进肿瘤干细胞行为介导乳腺癌细胞的赫赛汀耐药性

2．1 引言

2．1．1 HER2概况和生物学背景

2．1．2 ARTN概况和生物学背景

2．1．3 HER2、ARTN与肿瘤干细胞的联系及相关研究

2．2 实验材料和方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 建立稳转细胞系

2．2．3 建立赫赛汀耐药性细胞株

2．2．4 细胞的药物刺激处理

2．2．5 Western Blot检测细胞蛋白水平

2．2．6 实时定量PCR

2．2．7 细胞活力检测MTT

2．2．8 Soft Agar软琼脂克隆形成实验

2．2．9 三维细胞培养(3D-culture)

2．2．10 小鼠体内成瘤实验

2．2．11 免疫组织化学(IHC)

2．2．12 末端转移酶脱氧尿苷三磷酸末端标记(terminal transferase deoxyuridine triphosphate nick end labelling)(TUNEL)实验

2．2．13 Mammosphere球囊形成实验

2．2．14 流式细胞术

2．2．15 临床样本分析

2．3 实验结果

2．3．1 通过表皮生长因子(EGF)以及神经生长因子(Heregulin)(HRG)激活HER2基因，ARTN的表达显著增加

2．3．2 用赫赛汀抑制HER2能够导致ARTN表达水平的下降

2．3．3 在体外细胞实验中．过表达ARTN能够降低乳腺癌细胞对于赫赛汀的敏感性

2．3．4 在体外细胞实验中，敲除内源ARTN能够增加乳腺癌细胞对于赫赛汀的敏感性

2．3．5 在体内小鼠成瘤实验中，过表达ARTN能够降低乳腺癌细胞对于赫赛汀的敏感性

2．3．6 ARTN介导了乳腺癌细胞的赫赛汀获得性耐药性

2．3．7 在赫赛汀耐药性乳腺癌细胞中ARTN调节了肿瘤干细胞(CSC)的群体比例

2．3．8 在三维基质胶中，ARTN调节了赫赛汀耐药性乳腺癌细胞中肿瘤千细胞的生长

第三章 自分泌催乳素促进子宫内膜癌的生长、转移并降低对化疗药物的敏感性

3．1 引言

3．1．1 子宫内膜癌概论

3．1．2 催乳素概况和生物学背景

3．1．3 CD24概况和生物学背景

3．1．4 我们的工作解决的问题

3．2 实验材料和方法

3．2．1 分子克隆质粒构建

3．2．2 细胞培养

3．2．3 建立稳转细胞系

3．2．4 瞬时转染

3．2．5 半定量PCR(普通PCR)以及实时定量PCR

3．2．6 Western Blot检测细胞蛋白水平

3．2．7 细胞功能实验

3．2．8 细胞计数实验

3．2．9 5-溴脱氧尿嘧啶插入实验(BrdU)

3．2．10 细胞末端转移酶脱氧尿苷三磷酸末端标记(terminal transferase deoxyuridine triphosphate nick end labelling)(TUNEL)实验

3．2．11 Confocal激光共聚焦检测细胞骨架

3．2．12 细胞分散实验

3．2．13 Transwell(Migration，Invasion)细胞转移和侵袭实验

3．2．14 Wound healing划痕愈合实验

3．2．15 小鼠体内成瘤

3．2．16 小鼠尾静脉注射肿瘤细胞检测细胞转移

3．2．17 流式细胞术检测CD24

3．3 实验结果

3．3．1 自分泌催乳素促进子宫内膜癌的细胞增殖和致肿瘤性

3．3．2 敲除内源催乳素降低子宫内膜癌的细胞增殖和致肿瘤性

3．3．3 自分泌催乳素促进子宫内膜癌细胞的转移

3．3．4 自分泌催乳素促进子宫内膜癌细胞在小鼠体内的生长和转移

3．3．5 自分泌催乳素降低了子宫内膜癌细胞对于阿霉素和紫杉醇的敏感性

3．3．6 催乳素通过CD24的调节降低子宫内膜癌细胞对于阿霉素和紫杉醇的敏感性

第四章 结论和讨论

4．1 Artemin受HER2调节，通过促进肿瘤干细胞行为介导乳腺癌细胞的赫赛汀耐药性

4．2 自分泌催乳素促进子宫内膜癌的生长、转移并降低对化疗药物的敏感性

参考文献

附录1 实时定量PCR引物

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果