构建耐热性工程酵母发酵生物质生产乙醇

摘要

随着化石能源日益消耗，生物乙醇受到越来越多的关注。利用耐热酵母Kluyveromyces marxianus进行同时糖化与发酵(SSF)生物质既能提高生物质的利用率又能降低发酵过程中的能源成本。本课题对K.marxianus菌株进行基因工程操作改造以提高其对木糖和淀粉的发酵能力。
　　为了提高K.marxianus的木糖发酵能力，我们克隆了木糖还原酶（Kmxyl1），木糖脱氢酶（Kmxyl2）和木酮糖激酶（Kmxyl3）3个基因并进行性质研究，敲除K.marxianus YHJ010菌株的木糖还原酶基因和木糖脱氢酶基因使YHJ010菌株失去木糖利用能力得到YRL002菌株，再通过引入来自Orpinomyces的的木糖异构酶基因(XylA)使YRL002菌株重新获得木糖利用能力并得到YRL003菌株。通过在木糖合成培养基中驯化提高木糖利用能力，得到YRL005菌株。YRL005菌株在木糖培养基中生长速率可达0.137/h，并能在42℃发酵30.15 g/l木糖生产11.52 g/l乙醇，在45℃发酵16.6 g/l木糖生产5.21 g/l乙醇。除此之外，YRL005菌株还能利用玉米芯水解液在42℃发酵20.04 g/l木糖获得8.25 g/l乙醇。YRL005菌株是一个很好的发酵木糖生产乙醇的耐热酵母平台。
　　K.marxianus并不能直接发酵淀粉。在K.marxianus YZB010菌株中表达Aspergillus oryzae来源的α-淀粉酶和Debaryomyces occidentalis来源的α-淀粉酶和糖化酶，获得了可在较高温度下(＞40℃)利用未经糊化的生淀粉发酵的YRL009菌株。在42℃，YRL009菌株发酵200 g/l木薯淀粉生产66.52 g/l乙醇。如果提高起始接菌量，产量可达理论产值的78.3％(79.95 g/l)，而在45℃和48℃，发酵200g./l木薯淀粉可分别生产55.36 g/l和32.16g/l乙醇。除此之外，YRL009菌株还可以直接发酵木薯干粉。在不添加任何营养物质的培养基中，200 g/l木薯干粉（实含178.52 g/l木薯淀粉）可生产69.73 g/l乙醇。YRL009菌株，是已发表文献中是最好的能够利用生淀粉的耐热CBP酵母菌株。