缺氧对多孔钽-人成骨细胞复合物细胞增殖、分泌功能及成骨基因表达的影响

摘要

目的:本研究通过观察缺氧对接种于多孔钽支架材料上的成骨细胞形态学、增殖能力、分泌功能以及相关成骨细胞因子的影响，对比常氧和缺氧下成骨细胞功能的差异，证实缺氧对成骨细胞增殖、分泌功能的抑制作用，探讨多孔钽支架在模拟人体体内缺氧微环境下的生物相容性及在修复骨缺损、骨再生的作用，为进一步体内实验及临床应用提供实验依据。　　方法:　　1.大体及扫描电镜观察多孔钽支架形态特征。成骨细胞的培养和实验分组：选用MG63成骨细胞进行分离培养、传代及鉴定。将生长状态良好的第3代成骨细胞以1×106/L-1细胞浓度接种于多孔钽支架复合培养。设2％氧浓度环境作为缺氧模型，20%氧浓度环境作为常氧模型。设缺氧组（缺氧下成骨细胞单纯培养）和缺氧钽组（缺氧下成骨细胞与多孔钽共培养）作为实验组，与常氧对照组（常氧下成骨细胞单纯培养）作对比。　　2.成骨细胞形态学观察：倒置相差显微镜观察每日常氧及缺氧状态下成骨细胞生长；扫描电镜观察成骨细胞与多孔钽材料附着；透射电镜观察常氧和缺氧下成骨细胞超微结构改变；　　3.CCK-8法检测各组成骨细胞生长和增殖。　　4.ELISA法检测各组成骨细胞COL-Ⅰ、OC分泌水平。　　5.免疫细胞化学法检测各组成骨细胞COL-Ⅰ、OC表达。　　6.实时荧光定量PCR法检测各组多孔钽材料对成骨细胞COL-Ⅰ、OC基因表达。　　结果:　　1.多孔钽表面及断面可见分布均匀的蜂窝状孔隙，孔径针尖大。扫描电镜下材料表面及断面分布均匀直径约400～600μm的微孔结构，内部孔隙相互连通。孔隙为三维立体的连通结构，其结构类似于松质骨构架。　　2.倒置相差显微镜显示常氧下成骨细胞生长良好，细胞形态及大小均正常；短期缺氧细胞形态及数量未明显改变，第4d细胞数量较常氧下略少，第7d细胞未铺满瓶底，部分细胞脱落；扫描电镜显示：成骨细胞在多孔钽支架微孔内黏附、生长并分泌细胞外基质；透射电镜下显示：常氧下多孔钽-成骨细胞复合物细胞胞质内大量细胞器，核仁较大，大量分泌小泡，染色质丰富。缺氧下多孔钽-成骨细胞复合物细胞胞膜绒毛状小突起增多，细胞核固缩，染色质凝结，线粒体嵴肿胀。　　3.CCK-8法检测各组细胞增殖：缺氧下成骨细胞增殖能力较常氧下各组成骨细胞显著降低（P＞0.05），常氧钽组成骨细胞增殖能力高于常氧对照组；缺氧钽组、缺氧组成骨细胞增殖能力较常氧对照组显著减弱，随缺氧程度加深多孔钽-成骨细胞复合物细胞增殖能力逐渐减弱（P＜0.05）。　　4.ELISA法检测各组成骨细胞COL-Ⅰ、OC分泌水平：缺氧钽组、缺氧组成骨细胞COL-Ⅰ、OC分泌水平较常氧组显著降低（P＜0.05）；第7d缺氧钽组COL-Ⅰ分泌水平较缺氧组升高。5d、7d缺氧钽组成骨细胞OC分泌水平较缺氧组升高。　　5.免疫细胞化学检测各组成骨细胞COL-Ⅰ、OC的表达情况：缺氧组、缺氧钽组成骨细胞COL-Ⅰ、OC表达较常氧对照组显著降低（P＜0.05）。　　6.RT-QPCR检测各组成骨细胞COL-Ⅰ和OC基因表达情况：缺氧组、缺氧钽组成骨细胞COL-Ⅰ、OC基因相对表达量较常氧对照组明显降低（P＜0.05）。　　结论:　　1.多孔钽-成骨细胞复合物在不同缺氧条件下（3%PO2、2% PO2、1%PO2）伴随时间的延长及缺氧程度的加重，缺氧均可使各组成骨细胞的增殖能力减弱，其中以2%PO2、1% PO2效果最显著。　　2.严重缺氧可导致钽-成骨细胞复合物成骨细胞出现线粒体肿胀、线粒体嵴减少或消失，粗面内质网脱颗粒等超微结构病变。　　3.缺氧可抑制成骨细胞分泌细胞外基质COL-Ⅰ和OC，但当多孔钽-成骨细胞复合培养时，多孔钽3D空间结构可使成骨细胞COL-Ⅰ和OC分泌功能降低有所缓解。　　4.缺氧可使钽-成骨细胞复合物成骨细胞COL-Ⅰ和OC mRNA及蛋白表达均降低。　　提示：构建骨组织工程支架材料时，特别是当应用于体内骨缺损修复时要考虑到损伤区域氧分压，适宜的氧分压及氧浓度将有利于成骨细胞的生长。

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引言

第1章 实验研究

1. 1 材料与方法

1.1.1实验细胞及材料

1.1.2多孔钽的理化性质

1.1.3 MG63细胞的体外培养和鉴定

1.1.4缺氧装置选择和缺氧浓度的设定

1.1.5成骨细胞常氧及缺氧条件下形态学观察

1.1.6成骨细胞常氧及缺氧条件下与多孔钽支架复合培养及形态学观察

1.1.7 CCK-8法检测缺氧对多孔钽-成骨细胞复合物细胞增殖影响

1.1.8 ELISA法检测缺氧对多孔钽-成骨细胞复合物细胞COL-Ⅰ、OC分泌水平

1.1.9免疫细胞化学检测缺氧对多孔钽-成骨细胞复合物细胞COL-Ⅰ、OC表达

1.1.10 RT-QPCR检测缺氧对多孔钽-成骨细胞复合物细胞COL-Ⅰ、OC基因表达

1.1.11统计学分析

1. 2 结果

1.2.1多孔钽的制备及理化性质

1.2.2成骨细胞形态学观察及鉴定

1.2.3缺氧条件下多孔钽对各组成骨细胞增殖影响

1.2.4多孔钽-人成骨细胞形态学观察

1.2.5 ELISA法检测缺氧对多孔钽-成骨细胞复合物细胞COL-Ⅰ、OCN分泌的影响

1.2.6免疫细胞化学法检测缺氧对多孔钽-成骨细胞复合物细胞COL-Ⅰ、OC蛋白表达的影响

1.2.7实时荧光定量PCR检测缺氧对多孔钽-成骨细胞复合物细胞COL-Ⅰ、OC基因表达的影响

1. 3 讨论

1.3.1多孔钽材料物理特性及种子细胞的选择

1.3.2缺氧对多孔钽-人成骨细胞复合物细胞增殖、分泌的影响。

1.3.3缺氧对多孔钽-成软骨细胞复合物Col-Ⅰ和OC mRNA蛋白及基因表达的影响

1. 4 本章小结

参考文献

第2章 综述: 缺氧和酸中毒对成骨细胞增殖、分化功能的影响研究进展

2. 1氧分压和成骨细胞

2.1.1缺氧的因素

2.1.2缺氧对成骨细胞增殖分化的影响

2. 2酸碱平衡和成骨细胞

2.2.1酸中毒的成因

2.2.2酸中毒对成骨细胞增殖分化的影响

2. 3总结与展望

参考文献

结论

致谢

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